Uutiset

Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käyttämässäsi selainversiossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Sillä välin varmistaaksemme jatkuvan tuen hahmonnamme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Syöpäsolut ovat kehittäneet erilaisia ​​mekanismeja voittamaan solustressiä ja jatkamaan edistymistä.Proteiinikinaasi R (PKR) ja sen proteiiniaktivaattori (PACT) ovat ensimmäisiä vasteita, jotka seuraavat erilaisia ​​stressisignaaleja, jotka johtavat solujen lisääntymisen ja apoptoosin estoon.PACT-PKR-reitin säätely syöpäsoluissa on kuitenkin suurelta osin tuntematon.Täällä havaitsimme, että pitkä ei-koodaava RNA (lncRNA) aspartyyli-tRNA-syntetaasi antisense RNA 1 (DARS-AS1) on suoraan osallisena PACT-PKR-reitin estämisessä ja edistää syöpäsolujen lisääntymistä.Käyttämällä CRISPRi 971 syöpään liittyvän lncRNA:n laajamittaista toiminnallista seulontaa havaitsimme, että DARS-AS1 liittyi merkittävästi lisääntyneeseen syöpäsolujen lisääntymiseen.Siksi DARS-AS1 knockout estää solujen lisääntymistä ja edistää syöpäsolujen apoptoosia eri syöpäsolulinjoissa in vitro ja vähentää merkittävästi kasvaimen kasvua in vivo.Mekaanisesti DARS-AS1 sitoutuu suoraan PACT-aktivaatiodomeeniin ja estää PACT-PKR-vuorovaikutuksen vähentäen siten PKR-aktivaatiota, eIF2a-fosforylaatiota ja estämällä apoptoottista solukuolemaa.Kliinisesti DARS-AS1 ekspressoituu laajalti useissa syövissä, ja tämän lncRNA:n yli-ilmentyminen on osoitus huonosta ennusteesta.Tämä tutkimus selvittää PACT-PKR-reitin syöpäspesifistä säätelyä DARS-AS1 lncRNA:n avulla ja tarjoaa toisen kohteen syövän ennusteelle ja hoidolle.
Kyky sopeutua stressiin on tärkeä ominaisuus syöpäsolujen selviytymiselle ja lisääntymiselle.Syövän nopea lisääntyminen ja aineenvaihdunnan tunnusmerkit ovat huipussaan ankarissa mikroympäristöissä – ravinteiden puutteessa, hypoksiassa ja alhaisessa pH:ssa – mikä voi laukaista solukuoleman signalointireittejä.Syövässä havaitaan usein stressiherkkien geenien, kuten p535:n, lämpösokkiproteiinien 6, 7, KRAS8, 9 ja HIF-110, 11, 12, 13, säätelyhäiriöitä, mikä estää apoptoosin ja edistää eloonjäämistä.
Proteiinikinaasi R (PKR) on tärkeä stressianturi ja eukaryoottisen aloitustekijän 2α (eIF2α) alayksikkökinaasi, translaation säätelijä, joka yhdistää solustressin solukuolemaan.PKR tunnistettiin alun perin antiviraaliseksi proteiiniksi havaitsemalla vieras kaksijuosteinen RNA (dsRNA).Aktivoituessaan PKR fosforyloi eIF2a:n estääkseen virus- ja soluproteiinisynteesiä14,15,16.PACT (PKR-aktivaattoriproteiini) on tunnistettu ensimmäiseksi PKR-aktivaattoriproteiiniksi ilman dsRNA:ta17,18,19,20,21,22,23.Suoran vuorovaikutuksen kautta PKR:n kanssa PACT siirtää erilaisia ​​rasituksia (seerumin nälkä, peroksidi- tai arseniittikäsittely) PKR:lle ja alavirran signalointireiteille.eIF2α:n fosforylaation lisäksi PACT-välitteinen PKR-aktivaatio laukaisee erilaisia ​​stressivasteeseen liittyviä tapahtumia, mukaan lukien muuttunut redox-tila PI3K/Akt24-reitin kautta, tehostettu DNA-vaurioiden tarkistus p5325,26:n ja NF-κB27,28:n kautta, säätelee transkriptiota, 29. Kun otetaan huomioon niiden kriittinen rooli stressivasteessa, proliferaatiossa, apoptoosissa ja muissa tärkeissä soluprosesseissa, PKR ja PACT ovat lupaavia terapeuttisia kohteita monille sairauksille, erityisesti syövälle30, 31, 32, 33.Tästä pleiotrooppisesta toiminnallisesta ja biologisesta merkityksestä huolimatta PACT/PKR-aktiivisuuden säätely syöpäsoluissa on kuitenkin edelleen vaikeasti havaittavissa.
LncRNA:t ovat yli 200 nukleotidin transkripteja, joilla ei ole proteiinia koodaavaa potentiaalia.Koska huippuluokan koko genomin sekvensointiprojektit ovat tunnistaneet tuhansia lncRNA:ita, 35, 36 on tehty paljon työtä niiden biologisten toimintojen selvittämiseksi.Yhä useampi tutkimus on osoittanut, että lncRNA:t osallistuvat moniin biologisiin prosesseihin37, mukaan lukien X-kromosomin inaktivaation säätely38,39, imprinting40, transkriptio41,42, translaatio43 ja jopa syövän kasvu44,45,46,47.Nämä tutkimukset raportoivat, että monet lncRNA:t ovat mukana PACT/PKR-reitissä.Eräs tällainen tutkimus osoitti, että lncRNA ASPACT esti PACT-transkriptiota ja lisäsi PACT-mRNA:n tuman retentiota.Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että lncRNA nc886 sitoutuu PKR:ään ja estää sen fosforylaatiota49,50.Toistaiseksi PACT-välitteistä PKR-aktivaatiota säätelevää lncRNA:ta ei ole raportoitu.
Aspartyyli-tRNA-syntetaasin antisense-RNA 1 (DARS-AS1) on tunnistettu onkogeeniseksi lncRNA:ksi51,52,53,54.MiP-194-5p53:n, miP-12952:n ja miP-532-3p51:n säätelyn kautta DARS-AS1:n on osoitettu edistävän selkeäsoluisen munuaissolukarsinooman, kilpirauhassyövän ja ei-pienisoluisen keuhkokarsinooman kasvua.Tong ja kollegat havaitsivat myös, että DARS-AS1 edistää myelooman etenemistä ylläpitämällä proteiinin 39 (RBM39) RNA:ta sitovan motiivin stabiilisuutta.Ei kuitenkaan ole tehty tutkimuksia siitä, osallistuuko tämä lncRNA PACT-PKR-aktivaation ja syöpäsolujen stressivasteen säätelyyn.
Täällä suoritimme laajamittainen toimintahäviöseulon käyttämällä CRISPRi-järjestelmää ja totesimme, että DARS-AS1 lncRNA edistää useiden syöpäsolujen proliferaatiota.Lisäksi olemme tunnistaneet tärkeän mekanismin: DARS-AS1 sitoutuu suoraan PACT:iin, estää PACT- ja PKR-sitoutumista, estää eIF2a:n, alemman PKR-substraatin, fosforylaation ja lopulta estää apoptoottista solukuolemaa.Yhteenvetona totean, että työmme paljastaa DARS-AS1 lncRNA:n PACT-PKR-reitin säätelijänä ja mahdollisena kohteena syövän hoidolle ja ennusteelle.
Laajat genomisen profilointitutkimukset ovat tunnistaneet satoja syöpään liittyviä lncRNA:ita.Niiden tehtävä on kuitenkin suurelta osin tuntematon56.Tunnistaaksemme lupaavat lncRNA-ehdokkaat, jotka osallistuvat syövän etenemiseen, suoritimme toimintahäiriöseulonnan vähentyneen proliferaation havaitsemiseksi SW620-kolorektaalisyöpäsolulinjassa käyttämällä CRISPRi-järjestelmää (kuva 1a).SW480- ja SW620- paksusuolensyöpäsolulinjojen ainutlaatuinen ominaisuus on, että ne ovat peräisin yhden potilaan primaarisista ja sekundaarisista kasvaimista.Tämä tarjoaa arvokkaan vertailun edenneen paksusuolensyövän etenemisen geneettisten muutosten tutkimiseen.Siksi analysoimme paksusuolen syöpäsolulinjojen (SW480 ja SW620) transkriptejä RNA-sekvensoinnilla ja keräsimme joitain mahdollisia toiminnallisia lncRNA:ita julkaistusta kirjallisuudesta.Näiden tulosten perusteella suunnittelimme yhdistetyn sgRNA-kirjaston, joka sisältää 7355 sgRNA-oligoa, jotka kohdistuivat 971 syöpään liittyvään lncRNA:han ja 500 kohdentamattomaan sgRNA-oligoon negatiivista kontrollia varten (lisätiedot 1).
Kaavamainen esitys seulonnasta CRISPRi-järjestelmällä.b sgRNA-rikastus seulonnan jälkeen.Vaakasuuntainen katkoviiva edustaa log2:ta (kertamuutos) = ±0,58.Pystysuora katkoviiva osoittaa p-arvon = 0,05.Mustat pisteet edustavat ei-kohde-sgRNA:ta (nimetty NC:ksi).Punaiset pisteet ovat DARS-AS1:een kohdistuvia sgRNA:ita.Siniset pisteet ovat sgRNA:ita, jotka kohdistuvat LINC00205:een, aiemmin kuvattuun onkogeeniseen lncRNA:han.kertamuutos = (normalisoitu lukema, päivä 17)/(normalisoitu lukema, päivä 0).c DARS-AS1 sgRNA:n knockdown esti solujen kasvua.Virhepalkit edustavat ± kolmen kokeen keskihajontaa.* p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 kaksisuuntainen Studentin t-testi.d DARS-AS1:n ilmentyminen kasvaimissa (TCGA-aineisto).em DARS-AS1:n ilmentyminen parillisissa normaaleissa ja kasvainnäytteissä potilailta, joilla on vastaavasti BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP ja COAD (TCGA-aineisto).p-arvot saatiin käyttämällä parillista kaksisuuntaista Studentin t-testiä.
Plasmidin rakentamisen ja lentiviruksen pakkaamisen jälkeen transdusoimme dCas9-SW620-kolorektaalisyöpäsolulinjan yllä olevalla kirjastolla neljässä riippumattomassa infektiokokeessa.Näiden infektioiden monikertaisuus (MOI) oli 0,1–0,3, mikä osoittaa, että jokainen solu voidaan transfektoida vain yhdellä sgRNA:lla.18 päivän in vitro -viljelyn jälkeen kohde-sgRNA:iden rikastumisprofiili väheni tai lisääntyi seulonnan jälkeen, kun taas ei-kohdennettujen kontrollioligonukleotidien määrä pysyi suhteellisen muuttumattomana esiseulontaprofiiliin verrattuna, mikä osoittaa, että kohteellamme on erittäin seulontaspesifinen. kirjasto.Riisi.1b ja lisätaulukko 1). LINC00205, jonka on aiemmin raportoitu edistävän keuhkosyövän ja maksasyövän etenemistä58, 59, 60, seulottiin (log2 (kertamuutos) < -0,58, p-arvo < 0,05), mikä vahvisti tämän seulonnan luotettavuuden (kuva 1b). LINC00205, jonka on aiemmin raportoitu edistävän keuhkosyövän ja maksasyövän etenemistä58, 59, 60, seulottiin (log2 (kertamuutos) < -0,58, p-arvo < 0,05), mikä vahvisti tämän seulonnan luotettavuuden (kuva 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, jonka on aiemmin raportoitu edistävän keuhkosyövän ja maksasyövän etenemistä58, 59, 60, suljettiin pois (log2 (kertainen muutos) <-0,58, p-arvo <0,05), mikä vahvistaa tämän seulonnan kestävyyden (kuva .1b). . LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化）） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 了 该 筛选 的 （图） 1B）。 LINC00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （log2 （倍数 变化）） <-0,58 ， p 值 <0,05） ， 证实 了 该 筛选 的 （图） 1B）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1b). LINC00205, jonka on aiemmin raportoitu edistävän keuhkosyövän etenemistä58, 59, 60, jätettiin pois (log2 (kertainen muutos) <-0,58, p-arvo <0,05), mikä vahvistaa tämän seulonnan kestävyyden (kuvio 1b).
Kaikista testatuista lncRNA:ista seulottiin myös DARS-AS1, ja kolme samankaltaista sgRNA-oligonukleotidia vähenivät merkittävästi 18 päivän viljelyn jälkeen, mikä viittaa siihen, että tämän lncRNA:n kaatuminen johti syövän lisääntymisen vähenemiseen (kuvio 1b).Tätä tulosta tuki edelleen MTS-analyysi kolorektaalisissa syöpäsoluissa, mikä osoitti, että DARS-AS1 knockdown -solujen kasvunopeus oli vain puolittunut verrattuna kontrollisoluihin (kuva 1c) ja oli yhdenmukainen useiden muiden syöpätyyppien aikaisempien raporttien kanssa.: kirkassoluinen munuaissyöpä, kilpirauhassyöpä ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä51,52,53,55.Sen toiminta ja molekyylimekanismit kolorektaalisyövässä ovat kuitenkin edelleen tutkimatta.Siksi valitsimme tämän lncRNA:n lisätutkimuksia varten.
Tutkiaksemme DARS-AS1:n ilmentymistä potilailla analysoimme kattavasti 10 327 kasvainnäytettä Cancer Genome Atlas (TCGA) -projektista.Tuloksemme osoittavat, että DARS-AS1 ekspressoituu laajalti ja lisääntyy merkittävästi terveissä soluissa useissa eri kasvaimissa, mukaan lukien paksusuolen adenokarsinoomassa (COAD), munuaiskirkassolukarsinoomassa (KIRC) ja munuaispapillaarisolukarsinoomassa (KIRP)..Hyvin harvat (kuva 1d ja lisäkuvat 1a, b). Parillisten terveiden/kasvainnäytteiden analyysi vahvisti lisäksi merkittävästi korkeamman DARS-AS1:n ilmentymisen virtsarakon uroteelisyövän (BLCA), munuaiskirkassolusyövän (KIRC), eturauhasen adenokarsinooman (PRAD), keuhkojen levyepiteelikarsinooman (LUSC) kasvaimissa. , kohdun endometriumin syöpä (UCEC), keuhkojen adenokarsinooma (LUAD), maksan hepatosellulaarinen syöpä (LIHC), munuaisten munuaisten papillaarisolusyöpä (KIRP) ja paksusuolen adenokarsinooma (COAD) (p-arvo < 0,05) (Kuva 1e–m) . Parillisten terveiden/kasvainnäytteiden analyysi vahvisti lisäksi merkittävästi korkeamman DARS-AS1:n ilmentymisen virtsarakon uroteelisyövän (BLCA), munuaiskirkassolusyövän (KIRC), eturauhasen adenokarsinooman (PRAD), keuhkojen levyepiteelikarsinooman (LUSC) kasvaimissa. , kohdun endometriumin syöpä (UCEC), keuhkojen adenokarsinooma (LUAD), maksan hepatosellulaarinen syöpä (LIHC), munuaisten munuaisten papillaarisolusyöpä (KIRP) ja paksusuolen adenokarsinooma (COAD) (p-arvo < 0,05) (Kuva 1e–m) .Parillisten terveiden/kasvainnäytteiden analyysi vahvisti myös merkittävästi korkeamman DARS-AS1:n ilmentymisen virtsarakon uroteelikarsinoomassa (BLCA), kirkassoluisessa munuais- ja munuaissolukarsinoomassa (KIRC), eturauhasen adenokarsinoomassa (PRAD), keuhkojen okasolusyövän (LUSC) kasvaimissa., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m) . , kohdun limakalvosyöpä (UCEC), keuhkojen adenokarsinooma (LUAD), hepatosellulaarinen maksasyöpä (LIHC), munuaisten papillaarisolusyöpä (KIRP) ja paksusuolen adenokarsinooma (COAD) (p-arvo < 0,05) (Kuva 1e– m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 皮癌 (blca) 、 肾 肾 透明 细胞癌 (kirc) 、 前列 腺腺癌 (prad) 、 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的显着 更 高 表达 ， 子宫体子宫 内膜 癌 （（ucec） ， 肺腺癌 （lUAd） ， 肝肝 细胞癌 （（（（） ， 肾 肾 乳头状 细胞癌 （（） 和结肠腺癌 （coad） （P 值<0,05）(图1e-m）).配 对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 了 dars-OS1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 表达 ， 内膜 （（（ucel） 肺腺癌 （（） 肝肝 细胞癌 （（liHC） 肾 肾 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞癌 （kirp） （coad） （p 值<0,05）（图1e-m） .Terveiden/kasvainparillisten näytteiden analyysi tuki edelleen DARS-AS1:n roolia virtsarakon uroteelikarsinoomassa (BLCA), kirkassoluisessa munuaissolukarsinoomassa (KIRC), eturauhasen adenokarsinoomassa (PRAD) ja keuhkojen levyepiteelisyövässä (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). ilmentyminen corpus uterine karsinoomassa (UCEC), keuhkojen adenokarsinoomassa (LUAD), hepatosellulaarisessa karsinoomassa (LIHC), munuaisten papillaarisolukarsinoomassa (KIRP) ja paksusuolen adenokarsinoomassa (COAD) (p-arvo <0,05) (kuvio 1e -m).Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että DARS-AS1 ilmentyy laajasti ja voimakkaasti useissa syövissä.
Koska DARS-AS1:llä ja DARS:llä (antisense-juostetta koodaava geeni) on sama promoottori ja ne sijaitsevat vierekkäin, suunnittelimme shRNA:n poistamaan spesifisesti DARS-AS1:n, mutta ei DARS:ia (lisäkuvat 2a, b ja täydentävä taulukko 2). .SW620:n lisäksi käytimme myös kolmea muuta solulinjaa, jotka ekspressoivat voimakkaasti DARS-AS1:tä, tutkiaksemme shRNA-knockdownin tehokkuutta ja toimintaa (lisätaulukko 3).Tuloksemme osoittivat, että kaikki kolme kehitetty shRNA saavutti vähintään 80% DARS-AS1 knockdown tehokkuutta vähän vaikutusta määrään DARS mRNA (lisäkuva 2c-f).Lisäksi havaitsimme, että DARS-AS1-knockdown näillä shRNA:illa esti merkittävästi solujen kasvua paksusuolen syöpäsolulinjoissa SW620 (49,7 %) ja HCT116 (27,7 %), rintasyöpäsolulinjassa MBA-MD-231 (53,4 %).) ja HepG2-hepatoomasolulinja (92,7 %:n vähennys), sekä niiden kyky muodostaa ankkuroimattomia palloja (keskimääräinen vähennys -50,8 %, 44,6 %, 40,7 % ja 75,7 % solulinjaa kohti) (kuvio 2a, b).SW620:ssa pesäkkeiden muodostusmäärityksen tulokset vahvistivat edelleen, että DARS-AS1 shRNA inhiboi merkittävästi solujen lisääntymistä keskimäärin noin 69,6 %:n laskulla (kuvio 2c).
Kontrolli-shRNA:n ja DARS-AS1 shRNA:n vaikutus solujen lisääntymiseen (a) ja pallojen muodostumiseen (b) SW620-, HCT116-, MBA-MD-231- ja HepG2-soluissa.c Kontrolli-shRNA:n ja DARS-AS1 shRNA:n vaikutus pesäkkeiden muodostumiseen SW620-soluissa.DARS-AS1:tä yli-ilmentävien SW620-solujen soluproliferaatio (d), sferoidin muodostuminen (e) ja pesäkkeiden muodostuminen (f).Esitetyt tiedot ovat kolmen kokeen keskiarvo ± standardipoikkeama.*p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01 ja *** p ≤ 0,001 kaksisuuntaisella Studentin t-testillä.
Täydentämään toimintahäiriötutkimuksia loimme seuraavaksi SW620-soluja, jotka yliekspressoivat DARS-AS1:tä (täydentävä kuva 2g).DARS-AS1-yli-ilmentyminen lisäsi merkittävästi solujen kasvua (1,8-kertainen), ankkuroimattomien pallojen muodostumista (1,4-kertaisesti) ja pesäkkeiden muodostumista (3,3-kertaisesti) SW620-soluissa (kuvat 2d-f).Vahvistimme tämän tuloksen käyttämällä toista DARS-AS1:tä ilmentävää solulinjaa, A549.Tämä DARS-AS1:n yli-ilmentymisestä johtuva lisääntynyt solujen lisääntyminen havaittiin edelleen A549-soluissa (lisäkuva 2h, i ja täydentävä taulukko 3).Yhdessä nämä voitto- ja häviötutkimukset osoittavat, että DARS-AS1 edistää syöpäsolujen lisääntymistä in vitro.
Tutkiaksemme taustalla olevaa mekanismia, jolla DARS-AS1 säätelee solujen lisääntymistä, suoritimme RNA:n alasvetoanalyysin tunnistaaksemme sen mahdolliset proteiinia sitovat kumppanit.RT-qPCR-tulokset osoittivat, että noin 86,2 % DARS-AS1:stä sijaitsee SW620-solujen sytoplasmassa (täydentävä kuva 3a).In vitro transkriboitua biotinyloitua DARS-AS1:tä tai pseudoRNA:ta inkuboitiin sitten SW620-solulysaattien kanssa, mitä seurasi SDS-PAGE-erotus.Myöhempi hopeavärjäys osoitti, että erillinen vyöhyke (~ 38 kDa) rikastui merkittävästi DARS-AS1-vetonäytteissä, mutta ei vale-RNA- tai helminäytteissä (kuvio 3a).Tämä vyöhyke tunnistettiin PKR:ää aktivoivaksi proteiiniksi (PACT) massaspektrometrialla (MS) ja varmistettiin edelleen immunoblottauksella SW620-, HCT116- ja HepG2-solulinjoista (kuvio 3a, b).DARS:n ja siihen liittyvien PACT-proteiinien – PKR:n ja TRBP:n – rikastumista tutkittiin myös käyttämällä RNA-analyysiä Western blot -menetelmällä (WB).Tulokset osoittivat, että suoraa vuorovaikutusta DARS-AS1 RNA:n ja näiden kolmen proteiinin välillä ei löydetty (täydentävä kuva 3b).Spesifinen vuorovaikutus DARS-AS1:n ja PACT:n välillä vahvistettiin edelleen RNA-immunosaostus (RIP) -analyysillä, joka osoitti, että DARS-AS1 oli merkittävästi rikastunut anti-PACT-vasta-aineilla, mutta ei muilla kontrolli-RNA:illa (kuvio 3c).Sen määrittämiseksi, onko DARS-AS1 vuorovaikutuksessa suoraan PACT:n kanssa muiden solukomponenttien puuttuessa, suoritettiin in vitro -biokerrosinterferometria (BLI) -määritys käyttäen puhdistettua PACT:ia.Biotiinileimattu DARS-AS1 tai vale-RNA immobilisoitiin streptavidiinin (SA) biosensoreihin ja inkuboitiin sitten kineettisessä puskurissa, joka sisälsi 1 µM PACT.Erityisesti PACT sitoutui voimakkaasti DARS-AS1:een (KD-arvo ~ 26,9 nM), mutta ei matkimaan RNA:ta (kuvio 3d).Yhdessä nämä tulokset osoittavat suoran vuorovaikutuksen ja korkean affiniteetin DARS-AS1:n ja PACT:n välillä.
RNA-vetoanalyysi tunnisti DARS-AS1:n olevan vuorovaikutuksessa PACT:n kanssa SW620-soluissa.Yllä sukulaisten proteiinien hopeavärjäys.Alemmat immunoblotit suoritettiin anti-PACT-vasta-aineella.b RNA:n alasvetoanalyysi suoritettiin HCT116- (ylhäällä) ja HepG2-soluissa (alhaalla).PACT-rikastuminen havaittiin immunoblottauksella.cRNA-immunosaostus (RIP) -määritykset suoritettiin SW620-soluissa käyttäen osoitettuja vasta-aineita.d PACT-sitoutumiskäyrät täysimittaiseen DARS-AS1:een tai kontrolli-RNA:han saatiin käyttämällä biokerrosinterferometriaa (BLI).RNA immobilisoitiin streptavidiinibiosensoriin.Assosiaatioiden mittaamiseen käytettiin 1 μM PACT.e RNA pull -määritys suoritettiin käyttämällä biotinyloitua täyspitkää DARS-AS1:tä tai katkaistua (yläosa).Immunoblotti, jossa näkyy PACT vastaanotettu (alhaalla).f Puhdistettu leimattu PACT inkuboitiin biotinyloidun täyspitkän DARS-AS1:n kanssa tai typistettiin (kuten kohdassa e) in vitro RIP-määritystä varten.Uutettu RNA varmennettiin RT-qPCR:llä.g Eri RNA-fragmenttien suhteellinen affiniteetti PACT:lle saatiin käyttämällä biokerrosinterferometriaa.Analyysissä käytettiin 100 nM RNA:ta ja 1 µM RAST:ia.h In vitro RIP-määritykset suoritettiin käyttämällä puhdistettua ehjää tai typistettyä leimattua PACT:tä.Uutettu RNA varmennettiin RT-qPCR:llä.i DARS-AS1-, PACT- tai molempia yli-ilmentävien SW620-solujen kasvunopeus.j Täyspitkän tai typistetyn DARS-AS1:n yli-ilmentymisellä SW620-soluissa oli erilaisia ​​vaikutuksia solujen kasvuun.k Apoptoosi havaittiin immunoblottauksella anti-PARP-vasta-aineella.l DARS-AS1:n poistaminen indusoi SW620-solujen apoptoosia, kuten virtaussytometria osoittaa.Esitetyt tiedot ovat kolmen kokeen keskiarvo ± standardipoikkeama. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, kaksisuuntaisella Studentin t-testillä. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001, kaksisuuntaisella Studentin t-testillä. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 kaksisuuntaisella Studentin t-testillä. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 kaksisuuntaisella Studentin t-testillä.
Sitten loimme kolme biotinyloitua DARS-AS1-RNA-fragmenttia in vitro -transkriptiolla tunnistaaksemme PACT-assosiaatioon tarvittavan DARS-AS1-alueen (kuva 3e).RNA-analyysitulokset osoittivat, että jokainen fragmentti pystyi olemaan vuorovaikutuksessa PACT:n kanssa, mutta 3'-terminaalinen alue (384-768 nukleotidia merkittynä A3) osoitti yli 1-384 nukleotidia merkittynä A1) (kuva 3e).Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin in vitro RIP-määrityksessä käyttäen rekombinantti-PACT:tä (kuvio 3f).Näiden tulosten mukaisesti kokeet immobilisoitujen RNA-fragmenttien sitomiseksi PACTiin käyttämällä BLI:tä osoittivat myös, että PACT:lla on korkeampi affiniteetti A3:een (384–768 nt) (KD-arvo noin 94,6 nM), kun taas ei juuri mitään linkkejä muihin alueisiin.(Kuva 3d).
Tutkimme myös niihin liittyviä sitoutumisalueita PACT:ssa.PACT sisältää kolme toiminnallista domeenia, joista kaksi on konservoituneita kaksijuosteisia RNA:ta sitovia domeeneja (dsRBD) ja kolmas domeeni (nimetty D3), joka toimii proteiinivuorovaikutusten aktivaattorina.Kunkin domeenin lncRNA-sitoutumiskyvyn tutkimiseksi kehitimme kolme mutaatiota, jotka poistivat kunkin kolmesta domeenista, ja suoritimme in vitro RIP-määrityksen.Tuloksemme osoittivat, että PACT:n kolmannen domeenin (D3) deleetio vähensi merkittävästi sen vuorovaikutusta DARS-AS1:n kanssa (0,11-kertaisesti verrattuna ehjään PACT:iin) verrattuna kahteen muuhun mutaatioon (kuva 3h), ja osoitettiin, että vapautuminen D3:sta oli vuorovaikutuksessa DARSin kanssa.-AC1.Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että vuorovaikutus DARS-AS1:n ja PACT:n välillä voi tapahtua ensisijaisesti DARS-AS1:n 3'-pään ja PACT:n D3-alueen kautta.
Huomasimme, että DARS-AS1:llä ei ollut vaikutusta PACT-ilmentymiseen ja PACT:lla ei ollut vaikutusta DARS-AS1:een (täydentävä kuva 3c).Sitten tutkimme PACT-knockdownin vaikutusta solujen kasvuun.Toisin kuin DARS-AS1, suhteelliset solut kasvoivat 1,5–3 kertaa nopeammin, kun PACT kaadettiin (täydentävä kuva 3d).Pesäkkeiden muodostumismäärityksen tulokset osoittivat, että solut muodostivat 2-3-kertaisia ​​pesäkkeitä shRNA-käsittelyn jälkeen PACT:llä (täydentävä kuva 3e).Testaaksemme, sääteleekö DARS-AS1 solujen lisääntymistä PACT:n kautta, loimme SW620-soluja, jotka yliekspressoivat PACT:tä, DARS-AS1:tä tai molempia.PACT:n yli-ilmentyminen osoitti merkittävää soluproliferaation estoa (kuvio 3i).Vaikka DARS-AS1:n yli-ilmentyminen sinänsä edisti merkittävästi solujen lisääntymistä, DARS-AS1:tä ja PACT:tä yli-ilmentävien solujen kasvunopeudessa ei ollut merkittävää eroa.Nämä tulokset viittaavat siihen, että PACT voi estää DARS-AS1:n yli-ilmentymisen aiheuttaman lisääntyneen proliferaation.
Koska DARS-AS1:n eri alueilla on erilaiset PACT-sitoutumiskyvyt, tutkimme niiden suhteellista vaikutusta solujen lisääntymiseen DARS-AS1-fragmenttien erilaisella yli-ilmentämisellä.Verrattuna kahteen muuhun fragmenttiin DARS-AS1 oli yli-ilmentynyt 3'-päässä (384-768 nt), joka on tärkein PACT-liittyvä alue DARS-AS1:ssä, jolla oli korkein kyky stimuloida solujen lisääntymistä (kuva 3j).Nämä tulokset osoittavat positiivisen korrelaation DARS-AS1:n sitoutumiskapasiteetin ja biologisen toiminnan välillä.
PACT:n on raportoitu olevan pro-apoptoottinen proteiini19.Siksi tutkimme DARS-AS1:n vaikutusta apoptoosiin.Kuten odotettiin, DARS-AS1 knockdown lisäsi merkittävästi PARP-katkaisua SW620-soluissa ja lisäsi anneksiini V-positiivisten solujen osuutta SW620-, HCT116-, HepG2- ja MBA-MD-231-solulinjoissa (kuvio 3k).3).3f – h), mikä osoittaa, että DARS-AS1:n apoptoottinen vaikutus syöpäsoluissa on päinvastainen PACT:n apoptoosia indusoivalle toiminnalle.Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että DARS-AS1:n onkogeenisen toiminnan mekanismi voi olla PACT-toiminnan eston kautta.
Seuraavaksi tutkimme DARS-AS1-PACT-yhdistyksen toiminnallisia vaikutuksia.PACT:n on raportoitu aktivoivan PKR:n suoran vuorovaikutuksen kautta, mikä myöhemmin lisää eIF2a:n fosforylaatiota aiheuttaen translaatiodeleetiota ja apoptoosia17.Ensin tutkimme, vaikuttaako DARS-AS1 PACT:n ja PKR:n lokalisaatioon soluissa.Konfokaalinen fluoresenssimikroskopia osoitti, että PACT ja PKR olivat erittäin kolokalisoituneita SW620-soluissa keskimääräisellä Pearson-korrelaatiokertoimella 0,72.Samaan aikaan DARS-AS1:n yliekspressio vähensi merkittävästi PACT:n ja PKR:n yhteislokalisaatiota (keskimääräinen Pearson-korrelaatiokerroin 0,61) (kuva 4a).Tutkiaksemme, voisiko DARS-AS1 moduloida PACT-PKR-vuorovaikutusta, suoritimme yhteisimmunosaostus (co-IP) -määrityksen anti-PACT-vasta-aineella SW620-solulysaateissa.PKR oli erittäin rikastettu anti-PACT-aineella kontrollisoluissa, kun taas PKR:n talteenotto väheni merkittävästi DARS-AS1:tä yli-ilmentävien solujen lysaateissa (kuvio 4b).Puhdistettua leimattua PACT:tä ja PKR:ää käytettiin in vitro proteiinisitoutumismäärityksiin.Vastaavasti ne, jotka tarjosivat DARS-AS1:tä mutta eivät kontrolli-RNA:ta, osoittivat tukahdutettua PACT-PKR-vuorovaikutusta (kuvio 4c).Kaikki tulokset osoittivat, että DARS-AS1 häiritsi PACT- ja PKR-viestintää.
PACT:n ja PKR:n samanaikainen lokalisaatio kontrollisoluissa tai soluissa, jotka yliekspressoivat DARS-AS1:tä, havaittiin käyttämällä konfokaalista fluoresenssimikroskopiaa.Tumat värjättiin DAPI:lla.Tilastolliset tulokset saatiin 16 valokuvasta.b Yhteisimmunosaostus (co-IP) käyttämällä anti-PACT-vasta-ainetta kontrolli-SW620-solujen solulysaateissa tai soluissa, jotka yliekspressoivat DARS-AS1:tä.c Leimattua PACT:ta, puhdistettua PKR:ää ja transkriptoitua in vitro DARS-AS1:llä tai vale-RNA:lla inkuboitiin in vitro proteiinisitoutumisanalyysiä varten.Anti-flag-vasta-aineita käytettiin immunosaostukseen.d Immunoblotit osoitetuilla vasta-aineilla suoritettiin SW620- ja HCT116-soluissa, jotka oli transfektoitu kontrolli-shRNA:lla tai DARS-AS1-shRNA:lla, mitä seurasi seerumin nälkä.DARS-AS1:n ilmentymistasot muuttivat solujen herkkyyttä thapsigarginille.SW620-solut transfektoitiin DARS-AS1 shRNA:lla, DARS-AS1 yliekspressioplasmidilla tai kontrolliplasmidilla.Soluja käsiteltiin thapsigarginilla 48 tunnin ajan ja solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttämällä MTS-reagenssia.f In vitro -transkriptoitua DARS-AS1:tä tai vale-RNA:ta ja puhdistettua PACT:tä käytettiin in vitro -aktivaatiomääritykseen ja immunoblot-detektioon.g Immunoblottit käyttäen näitä vasta-aineita suoritettiin SW620-ctrl-soluille (vasemmalla) tai soluille, jotka yliekspressoivat PKR-mutantteja (oikealla).Nämä solut transfektoitiin sitten kontrolli-shRNA:lla tai DARS-AS1-shRNA:lla, mitä seurasi seerumin nälkä.h Virtaussytometria osoitti, että mutantti-PKR:n inaktivointi kompensoi DARS-AS1-indusoitua apoptoosia SW620-soluissa.i Immunoblotit osoitetuilla vasta-aineilla suoritettiin SW620 (vasemmalla) tai HCT116 (oikealla) soluissa.Solut, jotka on transfektoitu kontrolli-shRNA:lla tai DARS-AS1 shRNA:lla, ovat ilman seerumia ja niitä on täydennetty 100 nM:lla PKR C16-estäjää tai DMSO:ta.Mittakaavapalkki = 5 µm.Esitetyt tiedot ovat kolmen kokeen keskiarvo ± standardipoikkeama.* p ≤ 0,05 kaksisuuntainen Studentin t-testi.
Yleisesti uskotaan, että kun PACT on vuorovaikutuksessa PKR17:n kanssa, PKR:n fosforylaatio Thr451:ssä voidaan indusoida.Tuloksemme osoittivat, että PKR:n fosforylaation taso oli merkittävästi kohonnut DARS-AS1 knockdown -soluissa seerumin nälkään jättämisen jälkeen (kuva 4d ja täydentävä kuva 4a).Näin ollen havaitsimme, että DARS-AS1 shRNA lisäsi myös merkittävästi eIF2a:n, pääasiallisen PKR-substraatin, fosforylaatiota (kuva 4d ja täydentävä kuva 4a).Thapsigargin on ER-stressori, joka saa ER:n vapauttamaan Ca2+:a.Hoidon thapsigarginilla on raportoitu indusoivan PACT:n ilmentymistä ja aktivaatiota, joka on edelleen vuorovaikutuksessa PKR:n kanssa ja aktivoi sen, mikä johtaa apoptoosiin lisäämällä eIF2a:n fosforylaatiota18,61.Tässä käytimme thapsigarginia PACT/PKR-reitin stimulaattorina tutkiaksemme, voiko DARS-AS1 auttaa soluja voittamaan stressin estämällä PACT/PKR-reittiä.Havaitsimme, että DARS-AS1:n ilmentymistaso korreloi positiivisesti soluresistenssin kanssa thapsigarginille.SW620-solut, jotka yliekspressoivat DARS-AS1:tä, selvisivät paremmin, kun niitä käsiteltiin thapsigarginilla, kun taas solut, joissa oli DARS-AS1-knockdown, tulivat herkemmiksi (kuvio 4e).Näiden tulosten mukaisesti DARS-AS1:n yli-ilmentyminen vähensi thapsigarginin aiheuttamaa PKR-fosforylaatiota (täydentävä kuva 4b).Sitä vastoin thapsigargin-käsittelyn jälkeen PKR ja eIF2a fosforyloituivat suuremmassa määrin DARS-AS1 knockdown -soluissa verrattuna kontrollisoluihin (täydentävä kuva 4b).Mielenkiintoista on, että thapsigargin indusoi DARS-AS1:n ilmentymistä annosriippuvaisella tavalla, mikä saattaa viitata DARS-AS1:n stressinvastaiseen toimintaan (täydentävä kuva 4c).Lisäksi suoritimme in vitro -aktivaatiomäärityksiä näiden havaintojen vahvistamiseksi.Lyhyesti sanottuna PKR puhdistettiin solulysaateista käyttämällä anti-PKR-vasta-ainetta, sitten inkuboitiin rekombinantin PACT:n ja in vitro transkriptoidun DARS-AS1:n kanssa.Entsymaattisen reaktion jälkeen fosfo-PKR havaittiin käyttämällä WB:tä.Tuloksemme osoittivat, että DARS-AS1 esti merkittävästi PKR-fosforylaatiota, mutta ei kontrolli-RNA:ta (kuvio 4f).Nämä in vitro ja in vivo -tulokset viittaavat siihen, että DARS-AS1 estää PACT-välitteistä PKR-aktivaatiota.Samaan aikaan havaitsimme myös PACT-palautumisen laskun DARS-AS1:n läsnä ollessa (kuva 4f).Tämä tulos on yhdenmukainen in vitro -proteiinisitoutumismäärityksen tulosten kanssa (kuvio 4c) ja havainnollistaa jälleen DARS-AS1:n estotoimintoa PACT-PKR-assosiaatiolle.
Ser246 ja Ser287 PACT:n D3-domeenissa tarvitaan PKR:n aktivaatioon solustressissä.Kahden seriinitähteen korvaaminen alaniinilla antoi mutantin PACT:n (mutD), joka aktivoi PKR:n ilman stressiä, ja alaniinin substituutio (mutA) muutti protokollan.Koska olemme osoittaneet tämän domeenin tärkeyden suorassa yhteydessä DARS-AS1:n kanssa, loimme nämä kaksi PACT-mutanttia testataksemme, voisivatko nämä tähteet myös osallistua vuorovaikutukseen DARS-AS1:n kanssa.Mielenkiintoista on, että molemmat mutantit menettivät kykynsä sitoutua DARS-AS1:een (täydentävä kuva 4d), mikä viittaa siihen, että PACT-proteiinin täydellinen rakenne voidaan tarvita tehokkaaseen vuorovaikutukseen DARS-AS1:n kanssa.
Lisäksi tulokset viittaavat myös siihen, että DARS-AS1-shRNA-indusoitu solujen lisääntymisen esto voidaan osittain palauttaa yli-ilmentämällä hallitsevaa negatiivista PACT-mutanttia (PACTmutA) tai hallitsevaa negatiivista PKR-mutanttia (PKRmut) (täydentävä kuva 4e. e).Dominantti-negatiivisten PKR-mutanttien yli-ilmentyminen vähensi DARS-AS1-knockdownin indusoimaa PKR-fosforylaatiota sekä eIF2a-fosforylaatiota seerumivajeissa olevissa soluissa (kuvio 4g).Vielä tärkeämpää on, että DARS-AS1-knockdownin indusoimien apoptoottisten solujen osuus väheni myös soluissa, jotka yliekspressoivat PKRmut:ia (kuvio 4h ja täydentävä kuva 4g).PKR-kinaasiaktiivisuuden esto heikentää myös DARS-AS1:n toimintaa, sillä tulokset osoittivat, että DARS-AS1-knockdown laukaisi harvoin PKR- ja eIF2a-fosforylaation, kun soluja käsiteltiin PKR-spesifisellä C16-inhibiittorilla (kuva 4i ja täydentävä kuva 4h).).Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että DARS-AS1 edistää solujen lisääntymistä, ainakin osittain, estämällä PACT-välitteisen PKR-aktivaation.
Tutkiaksemme edelleen DARS-AS1:n roolia tuumorigeneesissä suoritimme in vivo -kokeita käyttämällä hiiren ksenograftimallia. Tulokset osoittavat, että DARS-AS1:n tuhoutuminen vähensi dramaattisesti kasvaimen kasvua hiirissä (p-arvo < 0,0001) (kuvio 5a). Tulokset osoittavat, että DARS-AS1:n tuhoutuminen vähensi dramaattisesti kasvaimen kasvua hiirissä (p-arvo < 0,0001) (kuvio 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (ris. 5а). Tulokset osoittavat, että DARS-AS1-knockdown vähentää rajusti kasvaimen kasvua hiirissä (p-arvo < 0,0001) (kuvio 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0,0001）（囀5a（结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0,0001）（图5a） Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис.). Tulokset osoittivat, että DARS-AS1 knockdown vähensi merkittävästi kasvaimen kasvua hiirissä (p-arvo < 0,0001) (kuvio 5a).Siten DARS-AS1 knockdown -ryhmässä keskimääräinen kasvaimen tilavuus väheni merkittävästi noin 72,9 % ja kasvaimen keskimääräinen massa noin 87,8 % (kuvio 5b-d).Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että DARS-AS1 voi edistää merkittävästi kasvaimen kasvua in vivo.
Ad DARS-AS1 -knockdownin vaikutukset kolorektaaliseen onkogeneesiin nude-hiirillä.Kasvukäyrät (a), kasvaimen koko (b), paino (c) ja kasvainkuvat (d) näytetään.Virhepalkit edustavat ±SEM. n = 10. ****p < 0,0001, kaksisuuntaisella Studentin t-testillä. n = 10. ****p < 0,0001, kaksisuuntaisella Studentin t-testillä. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0,0001 kaksisuuntainen Studentin t-testi.n = 10. ****p < 0,0001，通过双尾学生t 检验. ****p < 0,0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0,0001 kaksisuuntainen Studentin t-testi.Kaplan-Meier analysoi DARS-AS1:n ilmentymistasojen ja kokonaiseloonjäämisen välistä korrelaatiota potilailla, joilla oli UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM ja LGG.Korkeat DARS-AS1:n ilmentymistasot potilailla olivat ylimmän 50 %:ssa;DARS-AS1-ilmentymisen alhainen taso potilailla oli alimmassa 50 %:ssa.p-arvot määritettiin log rank -testillä.f Ehdotettu malli, jossa DARS-AS1 säätelee PACT-PKR-reittiä ja kasvaimen kasvua.
Ymmärtääksemme paremmin DARS-AS1:n kliinistä vaikutusta, tutkimme sen ilmentymisen ja potilaan eloonjäämisen välistä korrelaatiota.Analysoimalla TCGA-aineistoa havaitsimme, että korkeampi DARS-AS1-ekspressio liittyi uveaaliseen melanoomaan (UVM), munuaisten kromofobiaan (KICH), munuaisten papillaarisolusyöpään (KIRP), mesotelioomaan (MESO), multipleksiin.Alhaisempi eloonjääminen liittyi merkitsevästi glioblastoomamorfoosiin (GBM) ja potilaisiin, joilla oli matala-asteinen aivojen gliooma (LGG) (kuva 5e).Nämä tulokset viittaavat siihen, että DARS-AS1:llä voi olla tärkeä rooli kliinisen kasvaimen etenemisessä ja se voi olla mahdollinen ennustava biomarkkeri useissa syövissä.
Tässä tutkimuksessa, käyttämällä laajamittaista CRISPRi-toiminnallista seulontaa, määritimme, että DARS-AS1 lncRNA voittaa syöpäsolustressin säätelemällä kahta keskeistä stressireaktiota, PACT:ia ja PKR:ää.Vuorovaikuttamalla suoraan PACT:n kanssa DARS-AS1 esti PACT-välitteistä PKR-aktivaatiota, estäen siten apoptoottista solukuolemaa ja edistäen solujen lisääntymistä (kuvio 5f).DARS-AS1:n lisääntymistä on havaittu useissa syöpätyypeissä, mikä viittaa siihen, että sen tehtävä edistää syöpäsolujen selviytymistä stressaavissa olosuhteissa voi olla laajalti sovellettavissa useisiin syöpätyyppeihin.
PACT on tunnistettu PKR-aktivaattoriproteiiniksi, ja PACT-välitteisellä PKR-aktivaatiolla on tärkeä rooli stressivasteissa säätelemällä transkriptiota, translaatiota, apoptoosia ja muita tärkeitä soluprosesseja62.Vuosikymmenten ajan on yritetty ymmärtää PACT-PKR-kaskadin syöpäspesifistä säätelyä.Tässä tutkimuksemme paljasti erilaisen PACT-PKR:n säätelymekanismin syöpäsoluissa solun lncRNA DARS-AS1:n kautta, joka sitoutuu suoraan PACT:iin, estää PACT-PKR-vuorovaikutuksen, estää PKR:n aktivaatiota ja eIF2α:n fosforylaatiota, mikä estää stressin aiheuttamaa apoptoosia ja stimuloi syövän mahdollista lisääntymistä.soluja.Tämä löytö valaisee mahdollisia lncRNA-kohteita syövän ennusteessa ja hoidossa.
Tietomme osoittivat, että DARS-AS1 knockdown herkistää solut seerumin nälkiintymiseen lisäämällä merkittävästi fosforyloitua PKR:ää ja eIF2a:aa.Nämä tulokset viittaavat siihen, että DARS-AS1 edistää syöpäsolujen selviytymistä ankarissa olosuhteissa estämällä PACT/PKR-aktiivisuutta.Useat muut ei-koodaavat RNA:t, kuten ASPACT ja nc886, ovat myös mukana PACT/PKR-akselissa alentamalla PACT48-mRNA:ta tai säätelemällä autofosforylaatiota sitoutumalla PKR49,50,64:ään.Niiden joukossa DARS-AS1 toimii PACT-PKR-yhdistyksen katkaisijana.Tämä tutkimus rikastuttaa ymmärrystämme PACT/PKR-akselin säätelystä ja lncRNA:iden roolista stressivasteissa.
PACT sisältää kolme erillistä aluetta.Kukin kahdesta ensimmäisestä dsRBD:stä riittää saavuttamaan PACT:n korkean affiniteetin sitoutumisen PKR:ään, kun taas kolmas domeeni (D3) tarvitaan PKR:n aktivaatioon in vitro ja in vivo.Tutkimuksemme osoitti, että DARS-AS1 on ensisijaisesti vuorovaikutuksessa D3-alueen kanssa (kuva 3h).Ottaen huomioon lncRNA:n suuren koon (768 nukleotidia), DARS-AS1:n sitoutuminen D3:een voi fyysisesti estää dsRBD:n ja PKR:n PACT-domeenin välistä vuorovaikutusta, mikä estää PACT:n ja PKR:n yhdistymisen.PACT-pistemutaatiot, jotka korvasivat Ser246:n ja Ser287:n D3:ssa alaniinilla tai aspartaatilla, häiritsivät sen sitoutumisaffiniteettia DARS-AS1:een, mikä osoittaa D3:n yleisten rakenteellisten ja sähköisten ominaisuuksien tärkeyden niiden yhteydessä.Tästä mekanismista tarvitaan lisää yksityiskohtia tulevaisuudessa käyttämällä tarkempaa biokemiallista analyysiä ja korkean resoluution PACT-rakenneanalyysiä.
Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että DARS-AS1 edistää solujen lisääntymistä useiden mekanismien kautta51,52,53.Yhdessä esimerkissä tutkijat havaitsivat, että DARS-AS1 tehosti antisense-proteiinia koodaavaa DARS-geeniään kohdistamalla miP-194-5p:n munuaissyöpäsoluihin.Tässä tutkimuksessa DARS-AS1:n knockdownilla oli kuitenkin vain vähän vaikutusta DARS-transkriptioon useissa syöpätyypeissä, mukaan lukien ainakin paksusuolen-, rinta- ja maksasyövät.Koska lncRNA:illa on solu- ja kudosspesifisiä ilmentymismalleja, toiminnalliset mekanismit eivät välttämättä säily syöpätyypeissä, mikä voi myötävaikuttaa tähän havaintojen ja eri syöpien aikaisempien arvioiden väliseen ristiriitaisuuteen.Erilaisten fysiologisten ja patologisten prosessien spesifisten mekanismien selvittämiseksi tarvitaan erityistutkimuksia.
Kliinisten tietojen analyysi osoitti, että DARS-AS1:n ilmentyminen kasvaimissa korreloi käänteisesti syöpäpotilaiden eloonjäämisen kanssa, mikä korostaa DARS-AS1/PACT/PKR-akselin merkitystä syövän ennusteessa.Yhteenvetona voidaan todeta, että tutkimuksemme osoittaa, että DARS-AS1 on PACT/PKR-signalointiakselin säätelijä, edistää syöpäsolujen proliferaatiota ja estää apoptoosia stressivasteen aikana, mikä tarjoaa toisen tutkimuslinjan ja on kiinnostava tulevaa tutkimusta varten mahdollisista hoitomuodoista. .
Ihmisen solulinjat SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ja HEK293T hankittiin National Cell Line Resource Infrastructuresta Kiinasta.Kaikkia soluja pidettiin DMEM-elatusaineessa (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), jota oli täydennetty 10 % FBS:llä (Gemini, Brooklyn, NY) ja 1 % penisilliini-streptomysiinillä (Thermo Fisher Scientific) 37 °C:ssa, 5 % C02:lla.hautomo.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);anti-eIF2a, Abcam (A0764));anti-eIF2a (fosfori S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (fosfori S246), Abgent (AP7744b);anti-p-tubuliini, CST (2128);normaali hiiren IgG, CST (5415S);normaali kanin IgG, CST (2729S).Vasta-aineet laimennettiin 1:1000 PBST:hen Western blottausta varten ja 1:100 IP:tä varten.
sgRNA:t kehitettiin käyttämällä julkisesti saatavilla olevaa työkalua nimeltä CRISPR-ERA66.Käytimme oletustyökaluparametreja sgRNA:n kehittämiseen ja algoritmi laski sgRNA:n sitoutumiskohdat 3 kb:n alueella.keskitetty TSS:ään.SgRNA-oligonukleotidipoolit syntetisoitiin yrityksessä CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ja kloonattiin humanisoituihin pgRNA-plasmideihin (Addgene #44248).Yhteensä 12 µg yhdistettyä humanisoitua pgRNA-plasmidia, 7,2 µg psPAX2:ta (Addgene #12260) ja 4,8 µg pMD2.G:tä (Addgene nro 12259) kotransfektoitiin 5 x 106 HEK293T-maljoille käyttäen DNA Transfect 10 cm:n reaktiomaljoja. soluja (CWBIO, Peking, Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti.Viruksia sisältävät supernatantit kerättiin 48 ja 72 tuntia transfektion jälkeen ja suodatettiin 0,45 um:n suodattimen läpi.Seulontaa varten dCas9/KRAB-fuusioproteiinia ekspressoivat SW620-solut saatiin virustransduktiolla.Modifioidut SW620-solut infektoitiin viruskirjastolla neljässä riippumattomassa infektiokokeessa MOI:lla 0,1-0,3 ja niistä otettiin näytteitä 2 µg/ml puromysiinillä (Sigma, St. Louis, MO) 2 päivän ajan.Sen jälkeen soluja viljeltiin 18 päivää in vitro kirjaston minimikattaessa 500 solua/sgRNA seulontaa varten.
Genominen DNA uutettiin QIAamp DNA Blood Midi Kit -sarjan (QIAGEN, Düsseldorf, Saksa; 51183) ohjeiden mukaisesti.Yhteensä 100 μg genomista DNA:ta biologista toistoa kohti käytettiin kirjaston rakentamiseen.SgRNA-alue monistettiin kahdella PCR-kierroksella ja liitettiin viivakoodiin.
PCR-tuotteet puhdistettiin käyttäen NucleoSpin®-geeliä ja PCR-puhdistuspakkausta (MACHEREY-NAGEL, Düren, Saksa; 740609.250) ja kvantifioitiin käyttämällä Qubit™ HS kaksijuosteisen DNA-detektiopakkausta (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
MTS-määritystä käytettiin soluproliferaation mittaamiseen.Solut kylvettiin 96-kuoppaisille levyille alkutiheydellä 2000 solua/kuoppa.Solujen suhteellinen lukumäärä mitattiin päivittäin ilmoitettuna aikana yhteensä 4-6 päivän ajan.Jokaista kuoppaa kohden 20 μl MTS-reagenssia (Promega) laimennettiin 100 μl:lla DMEM:ää, inkuboitiin solujen kanssa 4 tuntia 37 °C:ssa, ja sitten mitattiin OD490.
Ankkuroimattoman kasvun kyky löydettiin analysoimalla pallojen muodostumista.Lyhyesti sanottuna 2 000 solua, jotka oli transfektoitu shRNA DARS-AS1:llä tai kontrolli-shRNA:lla, viljeltiin erittäin matalan kiinnittymisen mikrolevyillä (Corning) vaihtamalla alustaa 4 päivän välein.Sferoidit laskettiin 14 päivän kuluttua.500 solua, jotka oli transfektoitu DARS-AS1-yliekspressioplasmidilla tai kontrolliplasmidilla, käytettiin tehostusmäärityksessä, muuten menetelmä pysyi muuttumattomana.
RNA transkriptoitiin käyttämällä T7-RNA-polymeraasia ja biotiini-16-UTP:tä (Roche 1138908910) Riboprobe® Combination Systemsin (Promega P1440) ohjeiden mukaisesti.Tässä käytetyt alukkeet on lueteltu lisätaulukossa 4.
Proteiinia koodaavat PACT- tai PKR-alueet kloonattiin pET15b:hen (Addgene #73619) ja transformoitiin BL21:een (DE3).Bakteereja inkuboitiin yön yli LB:ssä, johon oli lisätty ampisilliinia, ja sitten laimennettiin 100-kertaisesti tuoreella LB:llä.Kun alustan OD600 saavutti arvon 0,8, lisättiin 1 mM IPTG:tä proteiiniekspression indusoimiseksi.Kun oli inkuboitu yön yli kevyesti ravistellen (250 rpm 20 °C:ssa), solupelletti kerättiin sentrifugoimalla (4000 rpm, 10 min, 4 °C).Suspendoi solupelletti uudelleen lyysipuskuriin (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ja inkuboi jäissä 30 minuuttia, sitten sonikoita (15 min, 5 s päällä/pois, jäillä) ja sentrifugoi (13 000) rpm)., 30 min, 4 °С).Supernatantti ladattiin sitten Ni-NTA-hartsille (QIAGEN) 3 kertaa 4 °C:ssa, pestiin 4 kertaa pesupuskurilla (50 mM Tris, pH 8,0, 40 mM imidatsoli, 250 mM NaCl) ja eluoitiin 3 kertaa, yhteensä 10 ml eluenttipuskuria (50 mM Tris, pH 8,0, 250 mM NaCl, 300 mM imidatsoli).Puhdistettu proteiini määritettiin käyttämällä WB:tä ja pitoisuus määritettiin käyttämällä Qubit™-proteiinimäärityspakkausta (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
RIP-määritykset suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla modifikaatioin.Lyhyesti sanottuna 1x RIP-puskuri (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 % NP-40, RNasiiniribonukleaasi-inhibiittori (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, proteaasi) hajottaa sytostaattisen 10-seoksen 1 x (Roche, 1 mM DTT) ja sentrifugoi nopeudella 13 000 rpm 15 minuuttia 4 °C:ssa.Supernatanttia inkuboitiin sitten proteiini A+G magneettihelmien (Millipore) kanssa, jotka oli konjugoitu 5 µg:lla anti-PACT-vasta-ainetta (Abeam) tai IgG:tä (CST).Helmet pestiin 5 kertaa 5x RIP-puskurilla, sitten digestoitiin proteinaasi K:lla (NEB).RNA uutettiin Trizolilla ja määritettiin RT-qPCR:llä.Alukkeet on esitetty lisätaulukossa 5.
In vitro RIP-määritys suoritettiin modifioidun standardin RIP-määritysprotokollan mukaisesti.Yhteensä 5 pmol in vitro -transkriptoitua RNA:ta laimennettiin 1 x RIP-puskurilla ja pariutettiin inkuboimalla 65 °C:ssa 5 minuuttia, mitä seurasi hidas jäähdytys huoneenlämpötilaan.Yhteensä 5 pmol ehjiä tai mutatoituja lippuleimattuja PACT-proteiineja puhdistettiin E. colista.Inkuboi renaturoidun RNA:n kanssa 2 tuntia 4 °C:ssa ja noudata yllä olevaa menettelyä anti-flag IP:n RIP-analyysissä.
RNA-pidennysanalyysiä varten 1 x 107 solua hajotettiin 1 xRIP-puskurilla.Kun oli sentrifugoitu 13 000 rpm 15 minuutin ajan 4 °C:ssa, supernatanttia esikäsiteltiin 30 µl:lla streptavidiinimagneettisia helmiä (Beckman) 2 tunnin ajan 4 °C:ssa.Puhdistettu lysaatti syötettiin sitten hiivan tRNA:lla ja sitä inkuboitiin 40 pmol:n kanssa renaturoitua RNA:ta yön yli 4 °C:ssa, sitten vielä 2 tuntia ja lisättiin 20 µl uusia streptavidiinimagneettisia helmiä, jotka oli estetty BSA:lla.Pesuvaihe koostui 4 kertaa 5x RIP-puskurilla ja 4 kertaa 1x RIP-puskurilla.Vastaavat proteiinit eluoitiin biotiiniluutiopuskurilla (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 12,5 mM D-biotiini, PMSF) ja erotettiin NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Gel (Invitrogen) avulla.Hopeavärjäyksen (Beyotime Biotechnology) jälkeen tietyt juovat leikattiin pois ja analysoitiin MS:llä.
Co-IP-analyysi suoritettiin PACT:n ja PKR:n välisen vuorovaikutuksen testaamiseksi.Lyhyesti sanottuna supernatanttilysaatit valmistettiin inkuboimalla 1 x 107 hajotettua solua 1 x RIP-puskurissa, mitä seurasi sentrifugointi 13 000 rpm:ssä 15 minuuttia 4 °C:ssa.Lysaatit ladattiin proteiini A + G magneettihelmillä, konjugoitiin 5 ug:lla anti-PACT-vasta-ainetta ja pyöritettiin varovasti yön yli 4 °C:ssa.Helmet pestiin 3 kertaa 5 x RIP-puskurilla, kahdesti 1 x RIP-puskurilla ja eluoitiin 1 x SDS-puskurilla.Talteen otettu proteiini analysoitiin SDS-PAGE-geelillä ja havaittiin WB:llä.
Kaksi pmol leimattua PACT:tä ja 1 pmol PKR:ää puhdistettiin E. colista.Laimenna 1 x RIP-puskuriin ja inkuboi 10 pmol:n kanssa renaturoitua RNA:ta 2 tuntia 4 °C:ssa.Sen jälkeen niitä inkuboitiin proteiini A+G magneettihelmikonjugoidun anti-leimatun vasta-aineen kanssa vielä kaksi tuntia.Helmet pestiin sitten neljä kertaa 1 x RIP-puskurilla ja eluoitiin 1 x SDS-puskurilla.WB havaitsi tuloksena saadun PACT:n ja PKR:n.