Uutiset

Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käyttämässäsi selainversiossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Sillä välin varmistaaksemme jatkuvan tuen hahmonnamme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Aktivoituihin estereihin tai fenoksiradikaaleihin perustuvia entsymaattisia läheisyysleimausmenetelmiä käytetään laajasti solunsisäisten proteomien ja proteiinivuorovaikuttajien kartoittamiseen elävissä soluissa.Aktivoidut esterit ovat kuitenkin vähemmän reaktiivisia, mikä johtaa laajaan leimaussäteeseen, ja peroksidikäsittelyn synnyttämät fenoksiradikaalit voivat häiritä redox-reittejä.Tässä raportoimme läheisyysleimauksesta riippuvaisen fotoaktivoinnin (PDPL) menetelmän, joka on kehitetty yhdistämällä geneettisesti miniSOG-valoherkistäjäproteiini kiinnostavaan proteiiniin.Sinisen valon laukaisemana ja altistusajan ohjaamana singlettihappi muodostuu ja sitten saavutetaan spatiotemporaalisesti erotettu histidiinitähteiden leimaus aniliinikoettimella.Osoitamme sen korkean tarkkuuden organellispesifisen proteomikartoituksen avulla.PDPL:n ja TurboID:n rinnakkainen vertailu osoittaa tarkemman ja kattavamman PDPL:n proteomisen kattavuuden.Seuraavaksi käytimme PDPL:ää sairauteen liittyvään transkription koaktivaattoriin BRD4 ja E3 Parkin ligaasiin ja löysimme aiemmin tuntemattomia vuorovaikutustekijöitä.Yli-ilmentymisen seulonnalla Parkinille tunnistettiin kaksi tuntematonta substraattia, Ssu72 ja SNW1, joiden hajoamista välittää ubikvitinaatio-proteasomireitti.
Proteiiniverkostojen tarkka karakterisointi on monien perussoluprosessien taustalla.Siksi erittäin tarkka proteiinivuorovaikutusten spatiotemporaalinen kartoitus tarjoaa molekyyliperustan biologisten reittien, sairauden patologioiden tulkitsemiseen ja näiden vuorovaikutusten katkaisemiseen terapeuttisia tarkoituksia varten.Tätä tarkoitusta varten menetelmät, jotka pystyvät havaitsemaan ajallisia vuorovaikutuksia elävissä soluissa tai kudoksissa, ovat erittäin toivottavia.Affiniteettipuhdistusmassaspektrometriaa (AP-MS) on historiallisesti käytetty kiinnostavien proteiinien (POI) sitoutumispartnereiden tunnistamiseen.Kvantitatiivisten proteomiikan menetelmien kehittämisen myötä syntyi Bioplex3.0, suurin AP-MS-pohjainen proteiiniverkkojen tietokanta.Vaikka AP-MS on erittäin voimakas, työnkulun solulyysi- ja laimennusvaiheet painottuvat kohti heikkoja ja ohimeneviä sitoutumisvuorovaikutuksia ja tuovat mukanaan lyysin jälkeisiä artefakteja, kuten harhaanjohtavia vuorovaikutuspareja, joilta puuttuu lokerointi ennen lyysiä.
Näiden ongelmien ratkaisemiseksi on kehitetty epäluonnollisia aminohappoja (UAA), joissa on silloittavia ryhmiä, ja entsymaattisia lähileimausalustoja (PL) (esim. APEX ja BioID)5.Vaikka UAA-menetelmää on sovellettu menestyksekkäästi monissa skenaarioissa ja se tarjoaa tietoa suorista proteiiniliimoista, UAA:n lisäyskohdan optimointi on edelleen tarpeen.Vielä tärkeämpää on, että se on stoikiometrinen leimausmenetelmä, josta puuttuu leimaustapahtumien katalyyttinen kääntäminen.Sitä vastoin entsymaattiset PL-menetelmät, kuten BioID-menetelmä, yhdistävät muokatun biotiiniligaasin POI7:ään, joka myöhemmin aktivoi biotiinin muodostaen reaktiivisen biotinyyli-AMP-esterivälituotteen.Entsyymi katalysoi ja vapauttaa aktivoidun biotiinipilven, joka leimaa proksimaaliset lysiinijäännökset.BioID vaatii kuitenkin yli 12 tuntia riittävän leimatun signaalin saamiseksi, mikä estää sen käytön ajallisen resoluution kanssa.Hiivanäyttöön perustuvaa suunnattua evoluutiota hyödyntäen TurboID suunniteltiin BioID:n perusteella tehokkaammaksi, mikä mahdollistaa tehokkaan leimauksen biotiinilla 10 minuutissa, mikä mahdollistaa dynaamisempien prosessien tutkimisen.Koska TurboID on erittäin aktiivinen ja endogeeniset biotiinipitoisuudet riittävät matalan tason leimaamiseen, taustaleimauksesta tulee mahdollinen ongelma, kun eksogeenisen biotiinin lisääminen edellyttää erittäin tehostettua ja ajoitettua leimaamista.Lisäksi aktivoidut esterit ovat heikosti reaktiivisia (t1/2 ~ 5 min), mikä voi johtaa suureen leimaussäteeseen, erityisesti sen jälkeen, kun viereiset proteiinit on kyllästetty biotiinilla 5. Toisessa lähestymistavassa muokatun askorbaattiperoksidaasin geneettinen fuusio (eli biotiini- fenoliradikaaleja ja mahdollistaa proteiinien leimaamisen minuutissa9, 10. APEXiä käytetään laajalti solunalaisten proteomien, kalvoproteiinikompleksien ja sytosolisten signaaliproteiinikompleksien tunnistamiseen.11, 12. Kuitenkin tarve suurille peroksidipitoisuuksille voi vaikuttaa redox-proteiineihin tai -reitteihin ja häiritä soluprosessit.
Siten uusi menetelmä, joka pystyy tuottamaan reaktiivisempia leimatun säteen vaimennuslajeja suurella tila- ja ajatarkkuudella häiritsemättä merkittävästi solureittejä, on tärkeä lisä olemassa oleviin menetelmiin. Reaktiivisten lajien joukossa singlettihappi herätti huomiomme lyhyen käyttöikänsä ja rajallisen diffuusiosäteensä vuoksi (t1/2 < 0,6 µs soluissa)13. Reaktiivisten lajien joukossa singlettihappi herätti huomiomme lyhyen käyttöikänsä ja rajallisen diffuusiosäteensä vuoksi (t1/2 < 0,6 µs soluissa)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого () Aktiivisista muodoista singlettihappi kiinnitti huomiomme lyhyen käyttöikänsä ja rajallisen diffuusiosäteensä vuoksi (t1/2 < 0,6 µs soluissa)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2揨京傉䈕 µs！ 1/2 < 0,6 µs）而引起了我们的注意13 << Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого 2.2.0 времени жизнич и огра. Aktiivisista muodoista singlettihappi kiinnittää huomiomme lyhyen käyttöikänsä ja rajallisen diffuusiosäteensä vuoksi (t1/2 < 0,6 μs soluissa).Yksittäisen hapen on raportoitu hapettavan satunnaisesti metioniinia, tyrosiinia, histidiiniä ja tryptofaania, mikä tekee siitä polaarisen 14,15 kiinnittyessä amiini- tai tiolipohjaisiin koettimiin16,17.Vaikka singlettihappea on käytetty subsellulaarisen osan RNA:n leimaamiseen, endogeenisten POI-läheisyysmarkkerien uudelleenkäyttöstrategioita ei ole tutkittu.Tässä esittelemme foorumin nimeltä photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), jossa käytämme sinistä valoa POI-kohteiden valaisemiseen, jotka on yhdistetty miniSOG-valoherkistäjään ja laukaisemme hapen muodostumisen proksimaalisten jäännösten hapettamiseksi, mitä seuraa amiinia sisältäviä modifikaatioita kemiallisten koettimien hapettamiseksi. eläviä välisoluja..Testasimme ryhmää kemiallisia koettimia maksimoidaksemme tunnisteen spesifisyyden ja tunnistimme muunnoskohdat käyttämällä avointa proteomiikan työnkulkua.PDPL:n ja TurboID:n rinnakkainen vertailu osoittaa tarkemman ja kattavamman PDPL:n proteomisen kattavuuden.Sovelsimme tätä lähestymistapaa subsellulaarisen proteomin organellispesifisiin markkereihin ja syöpään liittyvän epigeneettisen säätelyproteiinin BRD4:n ja Parkinsonin taudin E3-ligaasin Parkinin sitoutumispartnerien yleiseen proteomitunnistukseen, mikä vahvisti sekä tunnetun että tuntemattoman proteiiniverkoston. vuorovaikutuksia..PDPL:n kyky tunnistaa E3-substraatteja suurissa proteiinikomplekseissa edustaa tilannetta, jossa vaaditaan epäsuorien sitojien tunnistamista.Kaksi tuntematonta ubikvitinaatioproteasomin välittämää parkin-substraattia on vahvistettu in situ.
Fotodynaaminen hoito (PDT)19 ja kromoforiavusteinen laserinaktivointi (CALI)20, joissa valosäteilytys valoherkistimillä tuottaa singlettihappea, voi inaktivoida kohdeproteiineja tai aiheuttaa solukuoleman.Koska singlettihappi on erittäin reaktiivinen aine, jonka teoreettinen diffuusioetäisyys on noin 70 nm, avaruudellisesti rajoitettua hapettumista valoherkistimen ympärillä voidaan hallita.Tämän konseptin perusteella päätimme käyttää singlettihappea saavuttaaksemme proteiinikompleksien läheisen leimauksen elävissä soluissa.Olemme kehittäneet PDPL-kemoproteomisen lähestymistavan, joka täyttää neljä tehtävää: (1) katalysoida aktiivisen singlettihapen muodostumista, joka on samanlainen kuin PL-entsymaattinen lähestymistapa;(2) aikaansaada aikaerotteinen leimaus valon alkaessa;(3) muuttamalla (4) Vältä endogeenisten kofaktorien (kuten biotiinin) käyttöä taustan vähentämiseksi tai käytä erittäin häiritseviä eksogeenisiä reagensseja (kuten peroksideja) minimoimaan solujen altistuminen ympäristön stressille.
Valoherkistävät aineet voidaan jakaa kahteen luokkaan, mukaan lukien pienimolekyyliset fluoroforit (esim. ruusubengalinsininen, metyleenisininen)22 ja geneettisesti koodatut pienet proteiinit (esim. miniSOG, KillerRed)23.Modulaarisen suunnittelun saavuttamiseksi kehitimme ensimmäisen sukupolven PDPL-alustan lisäämällä valolle herkistäviä (PS) proteiineja POI24,25:een (kuva 1a).Sinisellä valolla säteilytettynä singlettihappi hapettaa proksimaaliset nukleofiiliset aminohappotähteet, mikä johtaa umpolung-polariteettiin, joka on elektrofiilinen ja voi edelleen reagoida amiinikoettimen nukleofiilien kanssa16,17.Anturi on suunniteltu alkyynikahvalla, joka mahdollistaa napsautuskemian ja vedetään alas LC/MS/MS-karakterisointia varten.
Kaaviokuva miniSOG:n välittämien proteiinikompleksien leimaamisesta.Kun solut altistetaan siniselle valolle, miniSOG-POI:ta ilmentävät solut tuottavat singlettihappea, joka modifioi vuorovaikutuksessa olevia proteiineja, mutta ei sitoutumattomia proteiineja.Amiinikemiallisen koettimen releet sieppaavat valohapetuksen välituotteet muodostaen kovalenttisia additiotuotteita.Kemiallisen koettimen alkynyyliryhmä sallii napsautuskemian rikastamista varten alasvetotoiminnolla, jota seuraa LC-MS/MS-kvantitointi.b Amiinikoettimien 1-4 kemiallinen rakenne.c Mitokondrioiden paikallisten miniSOG-välitteisten proteomimarkkerien edustava fluoresoiva geelianalyysi käyttämällä koettimia 1-4 ja suhteellista kvantifiointia geelidensitometrian perusteella.Kemiallisten koettimien signaali-tausta-suhde arvioitiin käyttämällä negatiivisia kontrollikokeita pois lukien sininen valo tai käyttämällä HEK293T-soluja ilman miniSOG-ilmentymistä.n = 2 biologisesti riippumatonta näytettä.Jokainen piste edustaa biologista kopiota.d Edustava PDPL:n havaitseminen ja kvantifiointi käyttämällä optimoitua koetinta 3 ilmaistujen PDPL-komponenttien, kuten c.n = 3 biologisesti riippumatonta näytettä.Jokainen piste edustaa biologista kopiota.Keskiviivat ja viikset edustavat keskiarvoa ja ± standardipoikkeamaa.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Singletin hapen konfokaalinen kuvantaminen pitkälle punaisella Si-DMA-värjäyksellä.Mittakaava: 10 µm.Geelikuvaus ja konfokaalikokeet toistettiin itsenäisesti vähintään kahdesti samanlaisilla tuloksilla.
Testasimme ensin kypsien valoherkistimien miniSOG26 ja KillerRed23 kykyä, jotka ilmentyvät stabiilisti HEK293T:ssä, välittää proteomin propargyyliamiinileimausta kemiallisena koettimena (täydentävä kuva 1a).Geelifluoresenssianalyysi osoitti, että koko proteomileimaus saavutettiin käyttämällä miniSOG- ja sinisen valon säteilytystä, kun taas KillerRedillä ei havaittu näkyvää leimaustuotetta.Signaali-tausta-suhteen parantamiseksi testasimme sitten sarjaa kemiallisia koettimia, jotka sisälsivät aniliinia (1 ja 3), propyyliamiinia (2) tai bentsyyliamiinia (4).Havaitsimme, että HEK293T-soluilla itsellään oli korkeampi taustasignaali verrattuna siniseen valoon, mikä johtui mahdollisesti endogeenisesta riboflaviinin valoherkistäjästä, flaviinimononukleotidista (FMN)27. Aniliinipohjaiset kemialliset koettimet 1 ja 3 antoivat paremman spesifisyyden, kun HEK293T ekspressoi stabiilisti miniSOG:ta mitokondrioissa, mikä osoitti > 8-kertaisen signaalin koettimen 3 koettimelle, kun taas RNA-leimausmenetelmässä CAP-seq käytetty koetin 2 näytti vain ~2,5- kertaiseksi signaalin kasvu, mikä johtuu todennäköisesti RNA:n ja proteiinin erilaisista reaktiivisuuspreferensseistä (kuvio 1b, c). Aniliinipohjaiset kemialliset koettimet 1 ja 3 antoivat paremman spesifisyyden, kun HEK293T ekspressoi stabiilisti miniSOG:ta mitokondrioissa, mikä osoitti > 8-kertaisen signaalin koettimen 3 koettimelle, kun taas RNA-leimausmenetelmässä CAP-seq käytetty koetin 2 näytti vain ~2,5- kertaiseksi signaalin kasvu, mikä johtuu todennäköisesti RNA:n ja proteiinin erilaisista reaktiivisuuspreferensseistä (kuvio 1b, c).Aniliinipohjaiset kemialliset koettimet 1 ja 3 osoittivat parempaa spesifisyyttä: HEK293T, joka ilmentää stabiilisti miniSOG:ta mitokondrioissa, osoittaa yli 8-kertaisen signaalin kasvun koettimelle 3, kun taas koetin 2, jota käytetään CAP-seq RNA -leimausmenetelmässä, vain osoittaa ~ 2,5-kertaista signaalin lisääntymistä, mikä johtuu luultavasti RNA:n ja proteiinin erilaisista reaktiivisuuspreferensseistä (kuvio 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 ， HEK293T 在 线 粒体 中 稳定 表达 Minisog ， 3 的 信号 增加> 8 倍 ， 而 用 于 于 标记 方法 cap-seq 的 探针 2 仅 显示 ~ ~ ~ ~ ~ ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性 ， HEK293T 在 粒体 中 稳定 表达 Minisog ， 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 于 于 于 RNA 标记 cap-eq 的 2 仅 ~ ~ ~ ~ 2,5 -倍信号增加，可能是由于RNAAniliinipohjaisilla kemiallisilla koettimilla 1 ja 3 oli parempi spesifisyys, HEK293T ekspressoi stabiilisti miniSOG:tä mitokondrioissa ja koettimessa 3 signaali oli yli 8-kertainen, kun taas CAP-seq RNA-leimausmenetelmän koetin 2 osoitti vain ~2,5-kertaista kasvua.signaalissa, luultavasti johtuen erilaisista reaktiopreferenssit RNA:n ja proteiinin välillä (kuvio 1b, c).Lisäksi testattiin koettimen 3 isomeerit ja hydratsiinikoettimet (koettimet 5, 6, 7), mikä vahvisti koettimen 3 optimoinnin (lisäkuva 1b, c).Samoin geelin sisäinen fluoresenssianalyysi paljasti muita optimoituja kokeellisia parametreja: säteilytyksen aallonpituuden (460 nm), kemiallisen koettimen pitoisuuden (1 mM) ja säteilytysajan (20 min) (täydentävä kuva 2a-c).Minkä tahansa komponentin tai vaiheen jättäminen pois PDPL-protokollasta johti merkittävään signaalin kääntymiseen taustalle (kuvio 1d).Erityisesti proteiinien leimaus väheni merkittävästi natriumatsidin tai troloxin läsnä ollessa, joiden tiedetään sammuttavan singlettihappea.D2O:n läsnäolo, jonka tiedetään stabiloivan singlettihappea, parantaa leimaussignaalia.Muiden reaktiivisten happilajien osuuden tutkimiseksi leimaamiseen lisättiin mannitolia ja C-vitamiinia hydroksyyli- ja superoksidiradikaalien sieppaajien muodostamiseksi, vastaavasti, 18, 29, mutta niiden ei havaittu vähentävän leimaamista.H2O2:n lisääminen, mutta ei valaistus, ei johtanut leimaukseen (täydentävä kuva 3a).Fluoresenssisinglettihappikuvaus Si-DMA-antureilla vahvisti singlettihapen läsnäolon HEK293T-miniSOG-langassa, mutta ei alkuperäisessä HEK293T-langassa.Lisäksi mitoSOX Red ei pystynyt havaitsemaan superoksidin tuotantoa valaistuksen jälkeen (kuva 1e ja täydentävä kuva 3b) 30. Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että singlettihappi on tärkein reaktiivinen happilaji, joka vastaa myöhemmästä proteomisesta leimaamisesta.PDPL:n sytotoksisuus arvioitiin mukaan lukien sinisen valon säteilytys ja kemialliset koettimet, eikä merkittävää sytotoksisuutta havaittu (täydentävä kuva 4a).
Leimausmekanismin tutkimiseksi ja proteiinikompleksien proteomisen tunnistamisen mahdollistamiseksi LC-MS/MS:n avulla meidän on ensin määritettävä, mitkä aminohapot ovat modifioituja ja koetinleimien deltamassa.Metioniinin, histidiinin, tryptofaanin ja tyrosiinin on raportoitu modifioituvan singlettihapella14,15.Integroimme TOP-ABPP31-työnkulun MSFragger32:een perustuvan FragPipe-laskenta-alustan tarjoamaan puolueettomaan avoimeen hakuun.Singlettihappimodifioinnin ja kemiallisen koettimen leimauksen jälkeen suoritettiin napsautuskemia käyttämällä biotiinin pelkistysleimaa, joka sisälsi pilkkoutuvan linkkerin, mitä seurasi neutravidiinivenyttely ja trypsiinin pilkkominen.Muokattu peptidi, joka oli edelleen sitoutunut hartsiin, valopilkkottiin LC-MS/MS-analyysiä varten (kuvio 2a ja lisätiedot 1).Suuri määrä modifikaatioita tapahtui kaikkialla proteomissa yli 50 peptidikartan (PSM) vastaavuuden ollessa lueteltuna (kuvio 2b).Yllättäen havaitsimme vain histidiinin modifikaatiota, mikä johtui todennäköisesti hapettuneen histidiinin korkeammasta reaktiivisuudesta aniliinikoettimia kohtaan kuin muut aminohapot.Julkaistun histidiinin hapettumismekanismin mukaan singlettihapella21,33 ehdotettu delta-massarakenne +229 Da vastaa koettimen 3 adduktia 2-oksohistidiinin kanssa kahden hapettumisen jälkeen, kun taas +247 Da on hydrolyysituote. +229 Da (lisäkuva 5).MS2-spektrin arviointi osoitti useimpien y- ja b-ionien tunnistamisen suuren luotettavuuden, mukaan lukien muunnettujen fragmentti-ionien (y ja b) tunnistaminen (kuvio 2c).PDPL-modifioitujen histidiinien paikallisen sekvenssin kontekstianalyysi paljasti kohtalaisen motiivien mieltymyksen pienille hydrofobisille tähteille ±1-asemissa (täydentävä kuva 4b).Keskimäärin tunnistettiin 1,4 histidiiniä proteiinia kohden, ja näiden markkerien paikat määritettiin liuottimella saavutettavan pinta-alan (SASA) ja suhteellisen liuottimen saatavuuden (RSA) analyysillä (lisäkuvat 4c, d).
Puolueeton työnkulku jäännösselektiivisyyden tutkimiseen käyttämällä MSFraggerin tuottamaa FragPipe-laskentaalustaa.Katkaisevia linkkereitä käytetään Click-kemiassa mahdollistamaan modifioitujen peptidien valopilkkominen streptavidiinihartsista.Avoin haku käynnistettiin lukuisten muutosten ja asiaankuuluvien jäänteiden tunnistamiseksi.b Määritä proteomissa tapahtuvien muutosten massa.Peptidikartoitus PSM.c Koettimella 3 modifioitujen histidiinikohtien MS2-spektriannotaatio. Edustavana esimerkkinä kovalenttinen reaktio koettimen 3 kanssa lisäsi +229,0938 Da modifioituun aminohappoon.d Mutaatiomääritys, jota käytettiin PDPL-markkerien testaamiseen.PRDX3 (H155A, H225A) ja PRDX1 (H10A, H81A, H169A) transfektoitiin villityypin plasmideilla anti-Flag-detektiota varten.e Synteettinen peptidi saatettiin reagoimaan puhdistetun miniSOG:n kanssa koettimen 3 läsnä ollessa ja vastaavat tuotteet, joiden Am +247 ja +229, havaittiin LC-MS-spektrissä.f In vitro proteiinien välinen vuorovaikutus mallinnettu miniSOG-6xHis-tagilla ja anti-6xHis-vasta-aineella.Koettimella 3 leimattujen miniSOG-6xHis/anti-6xHis-vasta-ainekompleksien antibiotiini (streptavidiini-HRP) ja anti-hiiri-Western blot -analyysi valolle altistuksen ajankohdasta riippuen.Yksittäisten proteiinien leimat ilmaistaan ​​vastaavassa molekyylipainossa: LC-vasta-aineen kevytketju, HC-vasta-aineen raskas ketju.Nämä kokeet toistettiin itsenäisesti vähintään kahdesti samanlaisilla tuloksilla.
Leimauskohdan biokemiallista todentamista varten massaspektrometrialla tunnistetut PRDX3 ja PRDX1 vaihdettiin histidiinistä alaniiniksi ja niitä verrattiin villityyppiin transfektiomäärityksissä.PDPL-tulokset osoittivat, että mutaatio vähensi merkitsevästi leimaamista (kuvio 2d).Sillä välin avoimessa haussa tunnistetut peptidisekvenssit syntetisoitiin ja saatettiin reagoimaan in vitro puhdistetun miniSOG:n kanssa koettimen 3 ja sinisen valon läsnä ollessa, jolloin saatiin tuotteita, joiden massasiirtymä oli +247 ja +229 Da LC-MS:llä havaittuna (kuva 1). . 2e).).Testataksemme, voidaanko vuorovaikutuksessa olevia proksimaalisia proteiineja leimata in vitro vasteena miniSOG-valoaktivaatiolle, suunnittelimme keinotekoisen läheisyysmäärityksen miniSOG-6xHis-proteiinin ja anti-His-monoklonaalisen vasta-aineen vuorovaikutuksella in vitro (kuva 2f).Tässä määrityksessä odotimme vasta-aineen raskaiden ja kevyiden ketjujen proksimaalista leimaamista miniSOG:lla.Itse asiassa anti-hiiri (tunnisti anti-6xHis-leimatun vasta-aineen raskaat ja kevyet ketjut) ja streptavidiinin Western blot -testit osoittivat raskaiden ja kevyiden ketjujen voimakasta biotinylaatiota.Huomasimme erityisesti miniSOG-autobiotinylaation johtuen 6xHis-tagista ja kevyiden ja raskaiden ketjujen välisistä ristisidoksista, mikä saattaa liittyä aiemmin kuvattuun lysiinin ja 2-oksohistidiinin proksimaalisen vasteen väliseen aukkoon.Lopuksi päättelemme, että PDPL modifioi histidiiniä läheisyydestä riippuvalla tavalla.
Seuraava tavoitteemme oli karakterisoida subsellulaarinen proteomi in situ -leimauksen spesifisyyden testaamiseksi.Siksi ekspressoimme stabiilisti miniSOG:tä HEK293T-solujen tumassa, mitokondriomatriisissa tai ER-ulkokalvossa (kuvio 3a).Geelifluoresenssianalyysi paljasti runsaasti leimattuja vyöhykkeitä kolmessa subsellulaarisessa paikassa sekä erilaisia ​​leimauskuvioita (kuvio 3b).Fluoresenssikuvausanalyysi osoitti PDPL:n korkean spesifisyyden (kuvio 3c).PDPL-työnkulkua seurasi napsautusreaktiot rodamiiniväreillä subsellulaaristen proteomien rajaamiseksi fluoresenssimikroskoopilla, ja PDPL-signaalit kolokalisoitiin DAPI:lla, mitokondrioiden seuranta- tai ER-seurantaohjelmilla, mikä vahvisti PDPL:n korkean tarkkuuden.Kolmen organellin sijainnin osalta PDPL:n ja TurboID:n rinnakkainen vertailu avidiinin Western blot -menetelmällä osoitti, että PDPL oli leimattu tarkemmin verrattuna vastaaviin kontrolleihin.PDPL-olosuhteissa ilmestyi enemmän leimattuja vyöhykkeitä, mikä osoitti enemmän PDPL-leimattuja proteiineja (lisäkuvat 6a-d).
kaavamainen esitys miniSOG-välitteisestä organellispesifisestä proteomileimauksesta.miniSOG kohdistaa mitokondriomatriisiin fuusion kautta ihmisen COX4:n (mito-miniSOG) N-terminaaliseen 23 aminohappoon, ytimeen fuusion kautta H2B:hen (nucleus-miniSOG) ja Sec61β:aan ER-kalvon sytoplasmisen puolen kautta (ER-miniSOG). ).Käyttöaiheita ovat geelikuvaus, konfokaalinen kuvantaminen ja massaspektrometria.b Edustavat geelikuvat kolmesta organellikohtaisesta PDPL-profiilista.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Edustavia konfokaalisia kuvia HEK293T-soluista, jotka ekspressoivat stabiilisti miniSOG:tä erilaisilla subsellulaarisilla lokalisoinneilla, jotka on havaittu vasta-aineella, joka on leimattu V5 (punainen).Subsellulaarisia markkereita käytetään mitokondrioissa ja ER:ssä (vihreä).PDPL-työnkulku sisältää miniSOG-leimattujen (keltaisella) subsellulaaristen proteomien havaitsemisen käyttämällä Cy3-atsidi-klikkauskemiaa.Mittakaava: 10 µm.d PDPL-merkittyjen proteomien vulkaaniset piirrokset eri organelleissa kvantifioituina leimaamattomalla kvantitatiivisella määrityksellä (n = 3 riippumatonta biologista koetta).Kaksipyrstöistä Studentin t-testiä käytettiin tulivuorilla.Villityyppiä HEK293T käytettiin negatiivisena kontrollina. Merkittävästi muuttuneet proteiinit on korostettu punaisella (p < 0,05 ja >2-kertainen ioni-intensiteetin ero). Merkittävästi muuttuneet proteiinit on korostettu punaisella (p < 0,05 ja >2-kertainen ioni-intensiteetin ero). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ja >2-кратная разница в интенсивности ионов). Merkittävästi muuttuneet proteiinit on korostettu punaisella (p < 0,05 ja > 2-kertainen ero ioni-intensiteetissä).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Merkittävästi muuttuneet proteiinit on korostettu punaisella (p < 0,05 ja > 2-kertainen ero ionivahuudessa).HEK293T-miniSOG:lle tärkeät, mutta HEK293T:lle merkityksettömät proteiinit näkyvät vihreänä.e Kokeista saatujen proteomisten aineistojen spesifisyyden analyysi d.Tilastollisesti merkitsevien proteiinien kokonaismäärä kussakin organellissa (punaiset ja vihreät pisteet) on merkitty yläreunaan.Histogrammit osoittavat organelleihin lokalisoituneita proteiineja MitoCarta 3.0:n, GO-analyysin ja A. Tingin et ai.ihmiset.Erilliset tietojoukot mitokondrioille, ytimille ja ER:lle.Nämä kokeet toistettiin itsenäisesti vähintään kahdesti samanlaisilla tuloksilla.Raakadata toimitetaan raakadatatiedostoina.
Geeli- ja kuvantamistulosten rohkaisemana leimatonta kvantifiointia käytettiin tunnistetun proteomin kvantifiointiin kussakin organellissa (lisätiedot 2).Transfektoimatonta HEK293T:tä käytettiin negatiivisena kontrollina taustamarkkerien vähentämiseksi. Tulivuorikaavioanalyysi osoitti merkittävästi rikastettuja proteiineja (p < 0,05 ja > 2-kertainen ioniintensiteetti) sekä yksittäisiä proteiineja, jotka ovat läsnä vain miniSOG-ilmentävissä linjoissa (kuva 3d punaiset ja vihreät pisteet). Tulivuorikaavioanalyysi osoitti merkittävästi rikastettuja proteiineja (p < 0,05 ja > 2-kertainen ioniintensiteetti) sekä yksittäisiä proteiineja, jotka ovat läsnä vain miniSOG-ilmentävissä linjoissa (kuva 3d punaiset ja vihreät pisteet). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Tulivuoren kaavioanalyysi osoitti merkittävästi rikastuneita proteiineja (p < 0,05 ja > 2-kertainen ioni-intensiteetti) sekä yksittäisiä proteiineja, jotka ovat läsnä vain miniSOG:tä ilmentävissä linjoissa (kuva 3d, punaiset ja vihreät pisteet).火山图 分析 显示 出 显着;火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （（p <0,05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 仅 存 在于 在于 在于 在于 表达 表达 的 单一 蛋白质 蛋白质 （图 图 3d 红色 绿色点 。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Tulivuorikaavioanalyysi paljasti merkittävästi rikastuneita proteiineja (p < 0,05 ja > 2x ionivahvuus) sekä yksittäisiä proteiineja, jotka olivat läsnä vain miniSOG-ekspressiolinjassa (punaiset ja vihreät pisteet kuvassa 3d).Yhdistämällä nämä tiedot tunnistimme 1364, 461 ja 911 tilastollisesti merkitsevää ydin-, mitokondrio- ja ER-ulkokalvoproteiinia, vastaavasti.Analysoidaksemme organelle-lokalisoidun PDPL:n tarkkuutta, käytimme MitoCarta 3.0:aa, Gene Ontology (GO) -analyysiä ja A. Ting et al.tietojoukkoa8 käytettiin mitokondrioille, ytimelle ja ER:lle testaamaan havaittujen proteiinien organellispesifisyys, mikä vastasi 73,4, 78,5 ja 73,0 %:n tarkkuutta (kuvio 3e).PDPL:n spesifisyys vahvistaa, että PDPL on ihanteellinen työkalu organellispesifisten proteomien tunnistamiseen.Varsinkin tunnistettujen mitokondrioproteiinien submitokondriaalinen analyysi osoitti, että loukkuun jäänyt proteomi jakautui pääasiassa matriisiin ja sisäkalvoon (vastaavasti 226 ja 106), mikä muodostaa 91,7 % (362) tunnistettujen mitokondrioproteiinien kokonaismäärästä.korkea PDPL-taso vahvistettiin lisäksi (lisäkuva 7a).Samoin subnukleaarinen analyysi osoitti, että siepattu proteomi jakautui pääasiassa ytimeen, nukleoplasmaan ja tumaan (täydentävä kuva 7b).Ydinproteominen analyysi ydinpaikannussignaalipeptidillä (3xNLS) osoitti samanlaisen tarkkuuden kuin H2B-konstruktilla (täydentävä kuva 7c-h).PDPL-markkerin spesifisyyden määrittämiseksi tumalaminiini A valittiin erillisemmin lokalisoiduksi POI7-ansaksi.PDPL tunnisti 36 merkittävästi rikastettua proteiinia, joista 12 proteiinia (30,0 %, mukaan lukien laminaatti A) oli hyvin karakterisoituja, String-tietokannan annotoituja lamin A:n vuorovaikutteisia proteiineja, joiden prosenttiosuus oli suurempi kuin BioID-menetelmällä (122 proteiinia) 28/28. , 22.9 %) 7. Menetelmämme identifioi vähemmän proteiineja, mahdollisesti rajoitetuista leimausalueista johtuen, minkä mahdollisti aktiivisempi singlettihappi.GO-analyysi osoitti, että tunnistetut proteiinit sijaitsivat pääasiassa nukleoplasmassa (26), tumakalvossa (10), tumakalvossa (9) ja tuman huokosissa (5).Yhdessä nämä tumaan lokalisoidut proteiinit muodostivat 80 % rikastetuista proteiineista, mikä edelleen osoittaa PDPL:n spesifisyyden (täydentävä kuva 8a-d).
Saatuamme selville PDPL:n kyvyn suorittaa läheisyysmerkintää organelleissa, testasimme sitten, voitaisiinko PDPL:ää käyttää POI-sitoutumispartnereiden analysointiin.Erityisesti pyrimme määrittelemään sytosolisten proteiinien PDPL-analyysin, joita pidetään vaikeampina kohteina kuin niiden kalvolokalisoidut vastineet niiden erittäin dynaamisen luonteen vuoksi.Bromodomaiini- ja ekstraterminaalinen (BET)-proteiini BRD4 on herättänyt huomiomme keskeisestä roolistaan ​​erilaisissa sairauksissa 35, 36 .BRD4:n muodostama kompleksi on transkription koaktivaattori ja tärkeä terapeuttinen kohde.BRD4:n ajatellaan säätelemällä c-myc- ja Wnt5a-transkriptiotekijöiden ilmentymistä akuutin myelooisen leukemian (AML), multippelin myelooman, Burkittin lymfooman, paksusuolensyövän ja tulehdussairauksien avaintekijänä37,38.Lisäksi jotkut virukset, kuten papilloomavirus, HIV ja SARS-CoV-236,39, kohdistuvat BRD4:ään säätelemään virusten ja solujen transkriptiota.
BRD4-vuorovaikutuksen kartoittamiseksi PDPL:n avulla yhdistimme miniSOG:n lyhyeen BRD4:n N- tai C-terminaaliseen isoformiin.Proteomiset tulokset paljastivat suuren päällekkäisyyden näiden kahden rakenteen välillä (täydentävä kuva 9a).MiniSOG-H2B:llä tunnistettu ydinproteomi kattaa 77,6 % proteiineista, jotka ovat vuorovaikutuksessa BRD4:n kanssa (täydentävä kuva 9b).Sitten eri valaistusaikoja (2, 5, 10, 20 min) käytettiin merkin säteen säätämiseen (kuva 4a ja lisätiedot 3).Päättelemme, että lyhyemmillä valojaksoilla PDPL leimaa ensisijaisesti suoria sitoutumispartnereita, kun taas pidemmät ajanjaksot sisältävät proteiineja, jotka tunnistetaan lyhyempien valoaktivaatiojaksojen aikana, sekä epäsuorat kohteet leimauskomplekseissa.Itse asiassa havaitsimme voimakkaan päällekkäisyyden vierekkäisten aikapisteiden välillä (84,6 % 2 ja 5 minuutin aikana; 87,7 % 5 ja 10 minuutin aikana; 98,7 % 10 ja 20 minuutin kohdalla) (kuva 4b ja täydentävä kuva 9c).Kaikista koeryhmistä löysimme BRD4-itseleimauksen lisäksi useita tunnettuja kohteita, kuten MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A ja HMGB1, jotka on merkitty merkkijonotietokantaan.Näiden kohteiden ionivahvuus on verrannollinen altistusaikaan (kuva 4c ja täydentävä kuva 9d).2 minuutin ryhmässä tunnistettujen proteiinien GO-analyysi osoitti, että tunnistetut proteiinit lokalisoituivat tumaan ja osallistuivat kromatiinin uudelleenmuodostukseen ja RNA-polymeraasin toimintaan.Proteiinin molekyylifunktio rikastui kromatiinin sitoutumisella tai transkription koaktivaatiolla, mikä oli yhdenmukainen BRD4-funktion kanssa (kuvio 4d).String-tietokantapohjainen proteiinivuorovaikutusanalyysi paljasti ensimmäisen tason epäsuorat vuorovaikutukset BRD4:n ja HDAC-perheen vuorovaikutuksessa olevien kompleksien, kuten SIN3A, NCOR2, BCOR ja SAP130 välillä (kuva 4e ja täydentävä kuva 9e), jotka ovat yhdenmukaisia ​​BRD4:ää ja HDAC:ta sitovien asetyloitujen histonien kanssa. ..Lisäksi LC-MS/MS:llä tunnistetut edustavat kohteet, mukaan lukien Sin3A, NSUN2, Fus ja SFPQ, varmistettiin Western blot -menetelmällä (kuvio 4f).Äskettäin BRD4:n lyhyen isomuodon on raportoitu muodostavan ytimiä, joilla on neste-nestefaasierotuksen (LLPS) ominaisuuksia.RNA:ta sitovat proteiinit Fus ja SFPQ välittävät eri soluprosessien LLPS:ää, ja ne on tunnistettu tässä kirjaamattomiksi BRD4:ää sitoviksi proteiineiksi.BRD4:n ja SFPQ:n välinen vuorovaikutus vahvistettiin yhteisimmunosaostus (co-IP) -kokeilla (kuvio 4g), mikä viittaa toiseen mekanismiin BRD4-välitteiselle neste-nestefaasierottelulle, joka ansaitsee lisätutkimuksia.Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että PDPL on ihanteellinen alusta tunnettujen BRD4-vuorovaikutteisten ja tuntemattomien sitovien proteiinien tunnistamiseen.
a Kaavamainen esitys miniSOG-välitteisestä BRD4-läheisyysmerkinnästä, valotusajat: 2, 5, 10 ja 20 min.b Eri valaistusaikoina tunnistettujen proteiinien päällekkäisyys.HEK293T-miniSOG-BRD4:ssä tunnistettu proteiinirikastuminen oli tilastollisesti merkitsevää verrattuna villityypin HEK293T:hen.c Ioniintensiteetti määritettäessä leimaamattomia edustavia tunnettuja BRD4:ää sitovia proteiineja määritellyn altistusajan aikana.n = 3 biologisesti riippumatonta näytettä.Tiedot esitetään keskiarvona ± standardipoikkeama.d 2 minuutin ryhmässä tunnistettujen proteiinien geeniontologinen analyysi (GO).Ensimmäiset kymmenen GO-termiä on listattu.Kuplat on värjätty GO-termikategorian mukaan, ja kuplien koko on verrannollinen kussakin termissä löydettyjen proteiinien määrään.e BRD4:n kanssa vuorovaikutuksessa olevien proteiinien merkkijonoanalyysi.Keltaiset ympyrät ovat suoraa liimaa ja harmaat ympyrät ovat ensimmäinen kerros epäsuoraa liimaa.Punaiset viivat edustavat kokeellisesti määritettyjä vuorovaikutuksia ja siniset viivat ennustettuja vuorovaikutuksia.f Edustavat BRD4:n sitoutumiskohteet, jotka tunnistettiin LC-MS/MS:ssä, varmistettiin Western blot -menetelmällä.g Yhteisimmunosaostuskokeet vahvistavat SFPQ:n ja BRD4:n välisen vuorovaikutuksen.Nämä kokeet toistettiin itsenäisesti vähintään kahdesti samanlaisilla tuloksilla.Raakadata toimitetaan raakadatatiedostoina.
Rekisteröimättömien POI-assosioituneiden kohteiden tunnistamisen lisäksi oletamme, että PDPL soveltuu entsyymien substraattien tunnistamiseen, mikä edellyttäisi epäsuoraan sitoutuvien proteiinien karakterisointia suurissa komplekseissa rekisteröimättömien substraattien merkitsemiseksi.Parkin (koodaa PARK2) on E3-ligaasi, ja parkin-mutaatioiden tiedetään aiheuttavan autosomaalista resessiivistä juveniili Parkinsonin tautia (AR-JP)42.Lisäksi parkin on kuvattu välttämättömäksi mitofagialle (mitokondriaalinen autofagia) ja reaktiivisten happilajien poistamiselle.Vaikka useita parkin-substraatteja on tunnistettu, parkinin rooli tässä taudissa on edelleen epäselvä.Sen karakterisoimattomien substraattien merkitsemiseksi PDPL testattiin lisäämällä miniSOG:ta parkinin N- tai C-päähän.Soluja käsiteltiin karbonyylisyanidi-protonin kuljettajalla m-kloorifenyylihydratsonilla (CCCP) parkiinin aktivoimiseksi PINK1-Parkin-reitin kautta.Verrattuna BRD4 PDPL -tuloksiimme parkin N-pään fuusio paljasti suuremman joukon kohdeproteiineja, vaikka se kattoi suuremman osan C-päästä (177/210) (kuvio 5a, b ja lisätiedot 4).tulos on yhdenmukainen niiden raporttien kanssa, joiden mukaan N-terminaaliset tagit voivat aktivoida Parkin44:n poikkeavasti.Yllättäen tiedoissamme oli vain 18 päällekkäistä proteiinia Parkin43:n julkaistujen AP-MS-tulosten kanssa, mikä johtuu todennäköisesti solulinjojen ja proteomiikan työnkulkujen välisistä eroista.Neljän tunnetun proteiinin (ARDM1, HSPA8, PSMD14 ja PSMC3) lisäksi, jotka on tunnistettu kahdella menetelmällä (kuvio 5c)43.LC-MS/MS-tulosten vahvistamiseksi edelleen käytettiin PDPL-käsittelyä ja sitä seuraavaa Western blottausta HEK293T-emosolumäärityksen ja stabiilin N-terminaalisen parkin-linjan tulosten vertaamiseen.Aikaisemmin tuntemattomat kohteet CDK2, DUT, CTBP1 ja PSMC4 testattiin tunnetulla sideaineella DNAJB1 (kuvio 5d).
Parkiinin kanssa vuorovaikutuksessa olevien proteiinien tulivuorikaavio HEK293T-soluissa, joissa on stabiilisti ekspressoitunut miniSOG, joka on fuusioitu parkinin N- tai C-päähän (n = 3 riippumatonta biologista koetta).Kaksipyrstöistä Studentin t-testiä käytettiin tulivuoren kolikoilla.HEK293T:tä käytettiin negatiivisena kontrollina. Merkittävästi muuttuneet proteiinit on korostettu punaisella (p < 0,05 ja >2-kertainen ioni-intensiteetin ero). Merkittävästi muuttuneet proteiinit on korostettu punaisella (p < 0,05 ja >2-kertainen ioni-intensiteetin ero). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 ja >2-кратная разница в интенсивности ионов). Merkittävästi muuttuneet proteiinit on korostettu punaisella (p < 0,05 ja > 2-kertainen ero ioni-intensiteetissä).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0,05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Merkittävästi muuttuneet proteiinit on korostettu punaisella (p < 0,05 ja > 2-kertainen ero ionivahuudessa).HEK293T-miniSOG:lle tärkeät, mutta HEK293T:lle merkityksettömät proteiinit näkyvät vihreänä.b Venn-diagrammi, joka esittää päällekkäisiä proteiineja N-terminaalisten ja C-terminaalisten konstruktien välillä.N-terminaaliset tagit voivat aktivoida poikkeavasti parkinin ja johtaa paremmin tunnistettaviin proteiineihin.c Venn-diagrammi, joka esittää päällekkäisiä proteiineja PDPL:n ja AP-MS:n välillä.Tunnetut vuorovaikutustekijät on lueteltu, mukaan lukien 4 18 päällekkäisestä proteiinista ja 11 PDPL:ssä spesifisesti tunnistetusta 159 proteiinista.d LC-MS/MS:llä tunnistetut edustavat kohteet varmistettiin Western blot -menetelmällä.e Ssu72 ja SNW1 tunnistettiin rekisteröimättömiksi parkin-substraateiksi.Nämä FLAG-merkityt proteiiniplasmidit transfektoitiin HEK293T:hen ja HEK293T-Parkin-miniSOG:hen, mitä seurasi CCCP-käsittely eri ajankohtina.Hajoaminen oli selvempää Parkinin yli-ilmentymislinjassa.f Proteasomi-inhibiittoria MG132 käyttämällä vahvistettiin, että Ssu72:n ja SNW1:n hajoamisprosessi välittyy proteasomi-ubikvitinaatiosta.Nämä kokeet toistettiin itsenäisesti vähintään kahdesti samanlaisilla tuloksilla.Raakadata toimitetaan raakadatatiedostoina.
Erityisesti PDPL:n tunnistamien proteiinien tulee sisältää parkinia sitovia proteiineja ja niiden substraatteja.Rekisteröimättömien parkin-substraattien havaitsemiseksi valitsimme seitsemän tunnistettua proteiinia (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ja SNW1) ja transfektoidut plasmidit altistaaksemme nämä geenit normaalille HEK293T:lle ja ekspressoidaksemme stabiilisti miniSOG-Parkinin ja sen jälkeen HEK293-käsittelyä.Ssu72- ja SNW1-proteiinien tasot alenivat merkittävästi stabiilissa miniSOG-Parkin-linjassa (kuvio 5e).Käsittely CCCP:llä 12 tunnin ajan johti molempien substraattien merkittävimpään hajoamiseen.Sen tutkimiseksi, sääteleekö Ssu72:n ja SNW1:n hajoamista proteasomi-ubikvitinaatio, proteasomi-inhibiittoria MG132 lisättiin estämään proteasomiaktiivisuutta, ja itse asiassa havaitsimme, että niiden hajoamisprosessi estyi (kuvio 5f).Muut ei-substraattikohteet vahvistettiin Parkin-vuorovaikuttajiksi käyttämällä Western blotting -menetelmää (lisäkuva 10), joka osoitti johdonmukaisia ​​tuloksia LC-MS/MS:n kanssa.Yhteenvetona voidaan todeta, että PDPL-työnkulun integrointi kohdeproteiinin transfektion varmentamiseen mahdollistaa rekisteröimättömien E3-ligaasisubstraattien tunnistamisen.
Olemme kehittäneet yhteisen läheisyysmerkintäalustan, jonka avulla voit tunnistaa avaruudessa ja ajassa vuorovaikutuksessa olevat POI-kohteet.Alusta perustuu miniSOG-valoherkistäjäproteiiniin, joka on vain noin 12 kDa, alle puolet kypsän APEX2-entsyymin koosta (27 kDa) ja kolmasosa TurboID:n koosta (35 kDa).Pienemmän koon pitäisi laajentaa huomattavasti sovellusaluetta pienten proteiiniinteraktomien tutkimiseen.Lisätutkimusta valolle herkistäviä aineita, olivatpa ne sitten geneettisesti koodattuja proteiineja tai pieniä molekyylejä, tarvitaan lisäämään singlettihapen kvanttisaantoa ja laajentamaan tämän lähestymistavan herkkyyttä.Nykyisessä miniSOG-versiossa korkea ajallinen resoluutio voidaan saavuttaa käyttämällä sinistä valaistusta läheisyysmerkkien aktivoimiseksi.Lisäksi pidempi valotusaika vapautti suuremman "pilven" singlettihappia, mikä johti distaalisten histidiinijäämien modifikaatioon, lisääntyneeseen leimaussäteeseen ja kykyyn hienosäätää PDPL-tilaresoluutiota.Testasimme myös seitsemän kemiallista koetinta signaali-taustasuhteen lisäämiseksi ja tutkimme tämän lähestymistavan takana olevaa molekyylimekanismia.TOP-ABPP-työnkulku yhdistettynä puolueettomaan avoimeen hakuun vahvisti, että modifikaatioita tapahtui vain histidiineissä, eikä johdonmukaista mikroympäristöä havaittu lisääntyneiden histidiinimodifikaatioiden suhteen, lukuun ottamatta histidiinien kohtalaista suosimista silmukka-alueella.
PDPL:tä on myös käytetty karakterisoimaan solunsisäisiä proteomeja, joiden proteomispesifisyys ja kattavuus ovat vähintään verrattavissa muihin lähileimaus- ja organellispesifisiin kemiallisiin koetinmenetelmiin.Läheisyysmarkkereita on myös käytetty menestyksekkäästi karakterisoimaan pinta-, lysosomaalisia ja eritteisiin liittyviä proteomeja46,47.Uskomme, että PDPL on yhteensopiva näiden subsellulaaristen organellien kanssa.Lisäksi haastoimme PDPL:n tunnistamalla sytosolisten proteiinien sitoutumisen kohteita, jotka ovat monimutkaisempia kuin kalvoon sitoutuneet proteiinit johtuen niiden dynaamisista ominaisuuksista ja osallistumisesta ajallisempiin vuorovaikutuksiin.PDPL:ää levitettiin kahdelle proteiinille, transkription koaktivaattorille BRD4 ja sairauteen liittyvälle ligaasille E3 Parkin.Nämä kaksi proteiinia ei valittu pelkästään niiden perustavanlaatuisten biologisten toimintojensa vuoksi, vaan myös niiden kliinisen merkityksen ja terapeuttisen potentiaalin vuoksi.Näille kahdelle POI:lle tunnistettiin hyvin tunnetut sitoutumiskumppanit sekä rekisteröimättömät kohteet.Erityisesti faasierotukseen liittyvä proteiini SFPQ vahvistettiin co-IP:llä, mikä voi viitata uuteen mekanismiin, jolla BRD4 (lyhyt isoformi) säätelee LLPS:ää.Samanaikaisesti uskomme, että Parkin-alustojen tunnistaminen on skenaario, jossa epäsuorien liimojen tunnistaminen vaaditaan.Tunnistamme kaksi tunnistamatonta parkin-substraattia ja vahvistimme niiden hajoamisen ubikvitinaatio-proteasomireitillä.Äskettäin on kehitetty mekanismiin perustuva pyyntistrategia hydrolaasisubstraattien havaitsemiseksi vangitsemalla ne entsyymeillä.Vaikka tämä on erittäin tehokas menetelmä, se ei sovellu suurten kompleksien muodostukseen osallistuvien substraattien analysointiin ja vaatii kovalenttisten sidosten muodostusta entsyymin ja substraatin välille.Odotamme, että PDPL:ää voidaan laajentaa tutkimaan muita proteiinikomplekseja ja entsyymiperheitä, kuten deubikvitinaasi- ja metalloproteaasiperheitä.
Uusi miniSOG-muoto, nimeltään SOPP3, on kehitetty parantamalla singlettihapen tuotantoa.Vertasimme miniSOG:ia SOPP3:een ja havaitsimme parantuneen merkintäsuorituskyvyn, vaikka signaali-kohinasuhde pysyi ennallaan (lisäkuva 11).Oletimme, että SOPP3:n optimointi (esim. suunnatun evoluution kautta) johtaisi tehokkaampiin valoherkistysproteiineihin, jotka vaativat lyhyempiä valoaikoja ja mahdollistavat siten dynaamisempien soluprosessien sieppaamisen.Erityisesti PDPL:n nykyinen versio on rajoitettu soluympäristöön, koska se vaatii sinisen valon valaistuksen eikä pysty tunkeutumaan syviin kudoksiin.Tämä ominaisuus estää sen käytön eläinmallitutkimuksissa.Optogenetiikan ja PDPL:n yhdistäminen voisi kuitenkin tarjota mahdollisuuden eläintutkimukseen, erityisesti aivoissa.Lisäksi muut suunnitellut infrapunavaloherkistimet poistavat myös tämän rajoituksen.Tällä alueella on parhaillaan käynnissä tutkimus.
HEK293T-solulinja saatiin ATCC:ltä (CRL-3216).Solulinja testattiin negatiiviseksi mykoplasmainfektion suhteen, ja sitä viljeltiin DMEM:ssä (Thermo, #C11995500BT), jota oli täydennetty 10 %:lla naudan sikiön seerumia (FBS, Vistech, #SE100-B) ja 1 % penisilliini/streptomysiinillä (Hyclone, #SV30010).kasvanut sisään.
3-aminofenyleeni (näyte 3) ja (4-etynyylifenyyli)metaaniamiini (näyte 4) ostettiin Bidepharmilta.Propyyliamiini (koetin 2) ostettiin Energy-chemicalsilta.N-(2-aminofenyyli)pent-4-ynamidi (koetin 1) syntetisoitiin julkaistujen menetelmien mukaisesti.
Täydentävä taulukko 1 luettelee tässä tutkimuksessa käytetyt geneettiset rakenteet.MiniSOG- ja KillerRed-sekvenssit kloonattiin P. Zoun (Pekingin yliopisto) lahjaplasmidista.Mitokondriomatriisiin kohdistuva sekvenssi johdettiin COX4:n 23 N-terminaalisesta aminohaposta ja kloonattiin osoitettuihin vektoreihin käyttämällä Gibson-kokoonpanoa (Beyotime, #D7010S).Endoplasmisen retikulumin kalvon ja tuman kohdistamiseksi SEC61B-ihmis-DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L), joka on monistettu PCR:llä HEK293T-solujen cDNA-kirjastosta, ja H2B-DNA (lahjoittaja D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) ja kloonattu, kuten edellä mainittiin.Ellei toisin mainita, muut transfektioon ja stabiilien solulinjojen rakentamiseen käytetyt proteiinigeenit PCR-monistettiin HEK293T-solun cDNA-kirjastosta.G3S (GGGS) ja G4S (GGGGS) käytettiin linkkereinä syöttiproteiinin ja miniSOG:n välillä.V5-epitooppimerkki (GKPIPNPLLGLDST) lisättiin näihin fuusiorakenteisiin.Nisäkkäissä ilmentämistä ja stabiilin solulinjan muodostamista varten miniSOG-fuusiokonstrukti subkloonattiin pLX304-lentivirusvektoriin.Bakteeriekspressiota varten miniSOG kloonattiin pET21a-vektoriin, joka oli leimattu 6xHis:llä C-päästä.
HEK293T-soluja ympättiin 2,0 x 105 solua kuoppaa kohden kuusikuoppaisille levyille ja transfektoitiin 24 tuntia myöhemmin rekombinanttisilla lentivirusplasmideilla (2,4 µg pLX304) ja viruspakkausplasmideilla (1,5 µg psPAX2 ja 1,2 µg psPAX2 ja 1,2 µg 0MDBeyo.Gtime) käyttäen p0MDBeyo8.0g:a. , #C0533), noin 80 % fuusio.Yön yli tapahtuvan transfektion jälkeen väliaine vaihdettiin ja inkuboitiin vielä 24 tuntia.Viruksen talteenotto suoritettiin 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua.Ennen kohdesolulinjojen infektiota viruselatusaine suodatettiin 0,8 μm:n suodattimen läpi (Merck, #millex-GP) ja lisättiin polybreeniä (Solarbio, #H8761) pitoisuuteen 8 μg/ml.24 tunnin kuluttua solujen annettiin toipua vaihtamalla väliainetta.Solut valittiin käyttämällä 5 µg/ml blastidiinia (Solarbio, #3513-03-9) kolmelle ensimmäiselle siirrolle alemman tiukan valintana.Sitten käytettiin 20 μg/ml tiukempana hoito-ohjelmana seuraaville kolmelle siirrolle.
Solut siirrostettiin 12-kuoppaisiin kammioihin (Ibidi, #81201) tiheydellä noin 20 000 solua kuoppaa kohti.HEK293T-solujen adheesion parantamiseksi lisää 50 ug/ml fibronektiiniä (Corning, #356008) laimennettuna fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS, Sangon, #B640435) 37 °C:ssa.Kammioita esikäsiteltiin 1 tunti ja poistettiin sitten PBS:llä.24 tunnin kuluttua solut pestiin kerran PBS:llä, inkuboitiin 1 mM koettimen 3 kanssa tuoreessa Hanksin tasapainotetussa suolaliuoksessa (HBSS, Gibco, #14025092) 1 tunti 37 °C:ssa ja inkuboitiin sitten sinisen LED:n kanssa (460 nm). ).) säteilytettiin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa.Sen jälkeen solut pestiin kahdesti PBS:llä ja kiinnitettiin 4 % formaldehydillä PBS:ssä (Sangon, #E672002) 15 minuuttia huoneenlämpötilassa.Ylimääräinen formaldehydi poistettiin kiinnitetyistä soluista pesemällä kolme kertaa PBS:llä.Sitten solut permeabilisoitiin 0,5 % Triton X-100:lla (Sangon, #A600198) PBS:ssä ja pestiin 3 kertaa PBS:llä.Poista sitten kammio ja lisää jokaiseen näytteeseen 25 µl click-reaktioseosta, joka sisältää 50 µM Cy3-atsidia (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4:a (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA:ta (konfluori, #BDJ-4). ja 0,5 mg/ml natriumaskorbaattia (Aladdin, nro S105024) ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa.Snap-reaktion jälkeen solut pestiin kuusi kertaa PBS:llä, joka sisälsi 0,05 % Tween-20:tä (Sangon, #A600560) (PBST), ja sitten blokattiin 5 % BSA:lla (Abcone, #B24726) PBST:ssä 30 minuuttia huoneenlämpötilassa.
Kolokalisaatioimmunovärjäystä varten soluja inkuboitiin primaaristen vasta-aineiden kanssa osoitettujen olosuhteiden mukaisesti: hiiren anti-V5-tunniste-mAb (1:500, CST, #80076), kanin anti-Hsp60-mAb (1:1000), ABklonaalinen, #A0564), kanin polyklonaalinen anti-kalneksiinivasta-aine (1:500, Abcam, #ab22595) tai kanin anti-lamiini A/C monoklonaalinen vasta-aine (1:500; CST, #2032) 4 °C:ssa yön yli.Kolmen PBST:llä pesun jälkeen soluja inkuboitiin sekundaaristen vasta-aineiden kanssa: vuohen anti-kani Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) laimennettuna 1:1000, vuohen anti-hiiri Alexa Fluor 594 (CST, #8889) laimennettuna 1:100.laimennus Laimenna huoneenlämpötilassa 30 minuuttia.Sitten solut pestiin 3 kertaa PBST:llä ja vastavärjättiin DAPI:lla (Thermo, #D1306) PBS:ssä 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa.Kolmen PBS-pesun jälkeen solut suljettiin 50 % glyseroliin (Sangon, #A600232) PBS:ssä kuvantamista varten.Immunofluoresoivat kuvat saatiin käyttämällä ZEISS LSM 900 Airyscan2 konfokaalimikroskooppia ja ZNE 3.5 -ohjelmistoa.
Singlettihappifluoresoivaa kuvantamista varten solut pestiin kahdesti Hanks HEPES -puskurilla ennen kuin lisättiin 100 nM Si-DMA Hanks HEPES -puskuriin (DOJINDO, #MT05).Valolle altistumisen jälkeen soluja inkuboitiin C02-inkubaattorissa 37 °C:ssa 45 minuuttia.Sitten solut pestiin kahdesti Hanksin HEPES-puskurilla ja vastavärjättiin Hoechstilla Hanksin HEPES-puskurissa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja visualisoitiin ZEISS LSM 900 -konfokaalimikroskoopilla., #M36008) HBSS-puskurissa, joka sisältää kalsiumia ja magnesiumia.Valolle tai doksorubisiinille (MCE, #HY-15142A) altistumisen jälkeen soluja inkuboitiin C02-inkubaattorissa 37 °C:ssa 10 minuuttia, pestiin kahdesti HBSS-puskurilla ja inkuboitiin Hoechstin kanssa HBSS-puskurissa huoneenlämpötilassa.pöytäkirja.Doksorubisiinia käytettiin positiivisena koetinkontrollina, jossa soluja käsiteltiin 20 µM doksorubisiinilla HBSS:ssä, joka sisälsi 1 % BSA:ta 30 minuutin ajan.Immunofluoresoivat kuvat saatiin Zeiss LSM 900 konfokaalimikroskoopilla.
HEK293T-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti mito-miniSOG:ta, kylvettiin noin 30 %:n tiheydellä 15 cm:n maljoihin.48 tunnin kuluttua, kun ~80 % konfluenssi saavutettiin, solut pestiin kerran PBS:llä, inkuboitiin 1 mM Probe 3:n kanssa tuoreessa HBSS-puskurissa 1 tunnin ajan 37 °C:ssa ja sitten valaistiin sinisellä LEDillä 10 minuuttia huoneessa. lämpötila..Sen jälkeen solut pestiin kahdesti PBS:llä, kaavittiin ja suspendoitiin uudelleen jääkylmään PBS-puskuriin, joka sisälsi EDTA-vapaita proteaasi-inhibiittoreita (MCE, #HY-K0011).Solut hajotettiin sonikoimalla kärkeä 1 minuutin ajan (1 sekunti päällä ja 1 sekunti pois päältä 35 %:n amplitudilla).Saatua seosta sentrifugoitiin nopeudella 15 871 xg 10 minuuttia 4 °C:ssa roskien poistamiseksi, ja supernatantin pitoisuus säädettiin arvoon 4 mg/ml käyttämällä BCA-proteiinimäärityspakkausta (Beyotime, #P0009).Yhdistä 1 ml yllä olevaa lysaattia 0,1 mM valossa hajoavaan biotiiniatsidiin (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP:iin (Sangon, #A600974), 0,1 mM TBTA-ligandiin (Aladdin, #T162437) ja 1 mM CuSO4-inkubaattoriin pohjalla. pyöritetään 1 tunnin ajan huoneenlämmössä.Snap-reaktion jälkeen lisää seos esisekoitettuun liuokseen (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) 10 ml:n lasipullossa.Näytteet sekoitettiin ja sentrifugoitiin 4500 g:ssä 10 minuuttia huoneenlämpötilassa.Alempi ja ylempi liuos heitettiin pois, sakka pestiin kahdesti 1 ml:lla metanolia ja sentrifugoitiin 15 871 x g 5 minuuttia 4 °C:ssa.Lisää 1 ml 8 M ureaa (Aladdin, nro U111902) 25 mM ammoniumbikarbonaatissa (ABC, Aladdin, nro A110539) sakan liuottamiseksi.Näytteet rekonstituoitiin 10 mM ditiotreitolilla (Sangon, #A100281 25 mM ABC:ssä) 40 minuutin ajan 55 °C:ssa, minkä jälkeen lisättiin 15 mM tuoretta jodiasetamidia (Sangon, #A600539) huoneenlämpötilassa pimeässä.Alkylointi 30 minuutissa..Lisättiin 5 mM ditiotreitolia reaktion pysäyttämiseksi.Valmista noin 100 µl NeutrAvidin agaroosihelmiä (Thermo, #29202) jokaista näytettä kohti pesemällä 3 kertaa 1 ml:lla PBS:ää.Yllä oleva proteomiliuos laimennettiin 5 ml:lla PBS:ää ja inkuboitiin esipestyjen NeutrAvidin-agaroosihelmien kanssa 4 tuntia huoneenlämpötilassa.Helmet pestiin sitten 3 kertaa 5 ml:lla PBS:ää, joka sisälsi 0,2 % SDS:ää (Sangon, #A600485), 3 kertaa 5 ml:lla PBS:ää, joka sisälsi 1 M ureaa, ja 3 kertaa 5 ml:lla ddH20:ta.Helmet kerättiin sitten sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen 200 µl:aan 25 mM ABC:tä, joka sisälsi 1 M ureaa, 1 mM CaCl2:a (Macklin, #C805228) ja 20 ng/μl trypsiiniä (Promega, #V5280).Trypsinoi yön yli 37 °C:ssa pyörittämällä.Reaktio pysäytettiin lisäämällä muurahaishappoa (Thermo, # A117-50), kunnes pH saavutti 2-3.Helmet pestiin 3 kertaa 1 ml:lla PBS:ää, joka sisälsi 0,2 % SDS:ää, 3 kertaa 1 ml:lla PBS:ää, joka sisälsi 1 M ureaa, ja sitten 3 kertaa 1 ml:lla tislattua vettä.Modifioidut peptidit vapautettiin kevyellä lyysillä (365 nm) 90 minuutin ajan käyttämällä 200 µl 70 % MeOH:ta.Sentrifugoinnin jälkeen supernatantti kerättiin.Helmet pestiin sitten kerran 100 μl:lla 70-prosenttista MeOH:ta ja supernatantit yhdistettiin.Näytteet kuivattiin Speedvac-tyhjiökonsentraattorissa ja säilytettiin -20 °C:ssa analyysiin asti.
Singlettien happimodifioitujen peptidien tunnistamiseksi ja kvantifioimiseksi näytteet liuotettiin uudelleen 0,1-prosenttiseen muurahaishappoon ja 1 µg peptidejä analysoitiin käyttämällä Orbitrap Fusion Lumos Tribrid -massaspektrometriä, joka oli varustettu Tunen ja Xcaliburin nano-ESI-lähteellä valmistajan ohjelmistosta 4.3.Näytteet erotettiin 75 um × 15 cm:n sisäisesti pakattuun kapillaaripylvääseen, jossa oli 3 um C18-materiaalia (ReproSil-pur, #r13.b9.) ja yhdistettiin EASY-nLC 1200 UHPLC -järjestelmään (Thermo).Peptidit erotettiin lineaarisella 95 minuutin gradienttikromatografialla 8 % liuottimesta B 50 % liuottimeen B (A = 0,1 % muurahaishappoa vedessä, B = 0,1 % muurahaishappoa 80 % asetonitriilissä), sitten nostettiin lineaarisesti arvoon 98 % B min. 6 minuutissa virtausnopeudella 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos kerää tietoja vuorotellen täyden MS-skannauksen ja MS2-skannauksen välillä tiedoista riippuen.Sputterointijännite asetettiin 2,1 kV:iin ja ioninkuljetuskapillaarin lämpötila oli 320°C.MS-spektrit (350-2000 m/z) kerättiin resoluutiolla 120 000, AGC 4 × 105 ja maksimisyöttöajalla 150 ms.Jokaisessa täydessä skannauksessa 10 yleisintä moninkertaisesti varattua esiastetta fragmentoitiin käyttämällä HCD:tä normalisoidulla törmäysenergialla 30 %, kvadrupolin eristysikkunalla 1,6 m/z ja resoluutiolla 30 000.AGC-tavoite tandem-massaspektrometrialle, jossa käytetään 5×104 ja maksimisyöttöaika 150 ms.Dynaaminen poikkeus on asetettu 30 sekuntiin. Määrittämättömät ionit tai ne, joiden varaus oli 1+ ja >7+, hylättiin MS/MS:lle. Määrittämättömät ionit tai ne, joiden varaus oli 1+ ja >7+, hylättiin MS/MS:lle. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Määrittämättömät ionit tai ionit, joiden varaus oli 1+ ja >7+, hylättiin MS/MS:lle.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Määrittämättömät ionit tai ionit, joiden varaukset olivat 1+ ja >7+, hylättiin MS/MS:lle.
Raakadata käsitellään MSFraggeriin perustuvalla FragPipe-laskenta-alustalla.Massapoikkeamat ja vastaavat aminohapot määritettiin käyttämällä avointa hakualgoritmia esiastemassan toleranssilla -150 - 500 Da.Modifioidut peptidit tunnistettiin sitten käyttämällä histidiinimodifikaatioita, joiden massakasvu oli +229,0964 ja +247,1069 Da PD:ssä (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Fuusioitua miniSOG-geeniä stabiilisti ilmentävät solut maljattiin 6 cm:n maljoille.Saavuttuaan ~80 % konfluenssin solut pestiin kerran HBSS:llä (Gibco, #14025092), sitten inkuboitiin kemiallisten koettimien kanssa HBSS:ssä 1 tunti 37 °C:ssa ja valaistiin sinisellä valolla.10 W LED 20 minuuttia huoneenlämmössä.Sen määrittämiseksi, minkä tyyppiset reaktiiviset happilajit ovat mukana PDPL:ssä, 0,5 mM C-vitamiinia (MCE, #HY-B0166), 5 mM Troloxia (MCE, #HY-101445), D2O:ta (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitolia (Energy Chemical, #69-65-8), 100 µM H202:ta, 10 mM NaN3:a lisättiin soluihin lisäaineina.Kylmällä PBS:llä pesun jälkeen solut kaavittiin, kerättiin 1,5 ml:n sentrifugiputkiin ja sonikoitiin kärjellä 1 minuutin ajan 200 µl:ssa PBS:ää, jossa oli 1 x proteaasi-inhibiittori ilman EDTA:ta (1 s ja 1 s ilman, amplitudi 35 %).Saatua seosta sentrifugoitiin nopeudella 15 871 x g 10 minuuttia 4 °C:ssa ja supernatantin pitoisuus säädettiin arvoon 1 mg/ml käyttämällä BCA-proteiinin määrityspakkausta.Noin 50 ui yllä olevaa lysaattia inkuboitiin 0,1 mM rodamiiniatsidin (Aladdin, nro T131368), 1 mM TCEP:n, 0,1 mM TBTA-ligandin ja 1 mM CuS04:n kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa pyörittämällä alhaalta ylös.Napsautusreaktion jälkeen suoritettiin saostus asetonilla lisäämällä näytteisiin 250 μl esijäähdytettyä asetonia, inkuboimalla -20 °C:ssa 20 minuuttia ja sentrifugoimalla nopeudella 6010 × g 10 minuuttia 4 °C:ssa.Kerää pelletti ja keitä 50 µl:ssa 1x Laemmlin puskuria 10 minuuttia 95 °C:ssa.Näytteet analysoitiin sitten SDS-PAGE-pitkillä geeleillä ja visualisoitiin käyttämällä Bio-rad ChemiDoc MP Touch -kuvausjärjestelmää Image Lab Touch -ohjelmistolla.
Rekombinantti-miniSOG-6xHis-proteiinin ilmentäminen ja puhdistus suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla.Lyhyesti, E. coli BL21(DE3) -solut (TransGen, #CD701-02) transformoitiin pET21a-miniSOG-6xHis:llä ja proteiinin ilmentyminen indusoitiin 0,5 mM IPTG:llä (Sangon, #A600168).Solujen hajoamisen jälkeen proteiinit puhdistettiin käyttämällä Ni-NTA-agaroosihelmiä (MCE, nro 70666), dialysoitiin PBS:ää vastaan ​​ja säilytettiin -80 °C:ssa.
Vasta-ainepohjaista in vitro -leimaläheisyysmääritystä varten sekoita 100 µM puhdistettua miniSOG:ta, 1 mM koetinta 3 ja 1 µg anti-leimaa hiiren monoklonaalista vasta-ainetta (TransGen, #HT501-01) PBS:ssä 50 µl:n kokonaisreaktiotilavuuteen..Reaktioseosta säteilytettiin sinisellä LED-valolla 0, 2, 5, 10 ja 20 minuuttia huoneenlämpötilassa.Seosta inkuboitiin 0,1 mM biotiini-PEG3-atsidin (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP:n, 0,1 mM TBTA-ligandin ja 1 mM CuS04:n kanssa 1 tunti huoneenlämpötilassa ylöspäin suuntautuvassa ravistelijassa.Snap-reaktion jälkeen lisää 4x Laemmlin puskuri suoraan seokseen ja keitä 95°C:ssa 10 minuuttia.Näytteet analysoitiin SDS-PAGE-geeleillä ja analysoitiin Western blot -menetelmällä streptavidiini-HRP:llä (1:1000, Solarbio, #SE068).
Histidiiniä sisältävää synteettistä peptidiä, jossa oli C-terminaalinen amidaatio (LHDALDAK-CONH2), käytettiin analysoimaan lähellä olevaa peptidipohjaista in vitro -leimausta.Tässä määrityksessä 100 µM puhdistettua miniSOG:ta, 10 mM koetinta 3 ja 2 µg/ml synteettistä peptidiä sekoitettiin PBS:ssä 50 µl:n kokonaisreaktiotilavuudessa.Reaktioseosta säteilytettiin sinisellä LED-valolla 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa.Yksi mikrolitra näytettä analysoitiin käyttämällä LC-MS-järjestelmää (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight -massaspektrometri MassLynx-spektrianalyysiohjelmistolla).
HEK293T-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti miniSOG-fuusiogeeniä, kylvettiin 10 cm:n maljoille linjoille, joilla oli erilainen organellilokalisaatio (Mito, ER, Nucleus) ja 15 cm:n maljoille Parkin-miniSOG- ja BRD4-miniSOG-linjoille.Saavuttuaan ~90 % konfluenssin solut pestiin kerran HBSS:llä, sitten inkuboitiin koettimen 3 kanssa HBSS:ssä 1 tunti 37 °C:ssa ja valaistiin 10 W sinisellä LEDillä huoneenlämpötilassa.Parkinin kosketuksettomaan leimaamiseen lisättiin 10 uM protonikarbonyylisyanidi-kantaja-m-kloorifenyylihydratsoni-CCCP (Solarbio, #C6700) koettimen 3 kanssa HBSS:ssä 1 tunnin ajaksi 37 °C:ssa.Solujen hajoamis-, napsautuskemia-, pelkistys- ja alkylointivaiheet olivat samat kuin edellä on kuvattu, paitsi että 2 mg lysaattia lisättiin ja biotiini-PEG3-atsidia käytettiin klikkausreaktiossa valohajoavan biotiiniatsidin sijasta.Rikastamisen jälkeen helmet pestiin 3 kertaa 5 ml:lla PBS:ää, joka sisälsi 0,2 % SDS:ää, 3 kertaa 5 ml:lla PBS:ää, joka sisälsi 1 M ureaa, ja 3 kertaa 5 ml:lla PBS:ää.Sen jälkeen 2 ug trypsiiniä lisättiin 300 ul:aan 25 mM ABC:tä, joka sisälsi 1 M ureaa proteiinin pilkkomiseksi yön yli 37 °C:ssa.Reaktio pysäytettiin lisäämällä muurahaishappoa, kunnes saavutettiin pH 2-3.Helmien päällä suoritetun trypsinoinnin jälkeen peptidiliuoksesta poistettiin suola käyttämällä SOLAµ HRP -kolonnia (Thermo, #60209-001) ja kuivattiin Speedvac-tyhjiökonsentraattorissa.Peptidit liuotettiin uudelleen 0,1-prosenttiseen muurahaishappoon ja 500 ng peptidejä analysoitiin käyttämällä Orbitrap Fusion Lumos Tribrid -massaspektrometriä, joka oli varustettu edellä kuvatulla nano-ESI-lähteellä.Peptidit erotettiin kaupallisilla RP-HPLC-esikolonneilla (75 µm x 2 cm) (Thermo, nro 164946) ja analyyttisillä RP-HPLC-kolonneilla (75 µm x 25 cm) (Thermo, nro 164941), jotka molemmat oli täytetty 2 µm:llä.gradientti 8 %:sta 35 % ACN:ään 60 minuutissa, sitten nostettiin lineaarisesti 98 %:iin B 6 minuutissa virtausnopeudella 300 Nl/min.MS-spektrit (350-1500 m/z) kerättiin resoluutiolla 60 000, AGC 4 × 105 ja maksimisyöttöajalla 50 ms.Valitut ionit fragmentoitiin peräkkäin HCD:llä 3 sekunnin jaksoissa normalisoidulla törmäysenergialla 30 %, kvadrupolin eristysikkunalla 1,6 m/z ja resoluutiolla 15 000. 5 × 104 tandemmassaspektrometrin AGC-tavoite ja maksimiruiskutusaika Käytettiin 22 ms.Dynaaminen poissulkeminen on asetettu 45 sekuntiin. Määrittämättömät ionit tai ne, joiden varaus oli 1+ ja >7+, hylättiin MS/MS:lle. Määrittämättömät ionit tai ne, joiden varaus oli 1+ ja >7+, hylättiin MS/MS:lle. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Määrittämättömät ionit tai ionit, joiden varaus oli 1+ ja >7+, hylättiin MS/MS:lle.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Määrittämättömät ionit tai ionit, joiden varaukset olivat 1+ ja >7+, hylättiin MS/MS:lle.
Näytteen valmistusvaiheet NeutrAvidin-helmien rikastamiseen asti olivat samat kuin edellä kuvatussa LC-MS/MS-analyysissä.Noin 50 μg lysaattia käytettiin syötteenä latauskontrolliin ja 2 mg lysaattia käytettiin napsautusreaktioihin.Rikastamisen ja neutravidiinilla pesun jälkeen sitoutuneet proteiinit eluoitiin lisäämällä 50 μl Laemmlin puskuria agaroosihartsihelmiin ja keittämällä 95 °C:ssa 5 minuuttia.Kontrollikuormitussyöttö ja helmirikastetut näytteet analysoitiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore, #ISEQ00010) tavanomaisilla Western blot -menetelmillä.Kalvot blokattiin 5 % rasvattomalla maidolla (Sangon, #A600669) TBS:ssä, joka sisälsi 0,1 % Tween-20:tä (TBST), ja inkuboitiin peräkkäin primääristen ja sekundaaristen vasta-aineiden kanssa.Primääriset vasta-aineet laimennettiin 1:1 000 5-prosenttiseen rasvattomaan maidoon TBST:ssä ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa.Sekundaarisia vasta-aineita käytettiin suhteessa 1:5000 ja niitä inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa.Kalvot visualisoitiin kemiluminesenssilla käyttäen Chemidoc MP -kuvausjärjestelmää.Kaikki kuvan leikkaamattomat blottien ja geelien skannaukset on esitetty raakatietoina.
Tässä tutkimuksessa käytettyjä primäärisiä vasta-aineita olivat kanin monoklonaalinen anti-SFPQ-vasta-aine (CST, nro 71992), kanin monoklonaalinen anti-FUS-vasta-aine (CST, nro 67840), kanin anti-NSUN2-polyklonaalinen vasta-aine (Proteintech, nro 20854-1-). AP), kanin polyklonaalinen anti-mSin3A-vasta-aine (Abcam, #ab3479), hiiren monoklonaalinen anti-tag-vasta-aine (TransGen, #HT201-02), hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiinivasta-aine (TransGen, #HC201-01), kaniinin vasta-aine - CDK2-monoklonaalinen vasta-aine (ABklonaalinen, #A0094), kanin monoklonaalinen vasta-aine CTBP1:tä vastaan ​​(ABclonal, #A11600), kanin polyklonaalinen vasta-aine DUT:lle (ABclonal, #A2901), kanin polyklonaalinen vasta-aine PSMC4:lle (ABklonaalinen, kanin anti-05), #A2 anti-05 DNAJB1-polyklonaalinen vasta-aine (ABclonal, # A5504).Näitä vasta-aineita käytettiin 1:1 000 laimennoksessa 5-prosenttisessa rasvattomassa maidossa TBST:ssä.Tässä tutkimuksessa käytetyt sekundaariset vasta-aineet sisälsivät anti-kanin IgG:n (TransGen, #HS101-01), anti-hiiri-IgG:n (TransGen, #HS201-01) laimennoksena 1:5000.
Sen tutkimiseksi, onko BRD4 vuorovaikutuksessa SFPQ:n kanssa, stabiileja HEK293T- ja BRD4-miniSOG-soluja, jotka yliekspressoivat HEK293T:tä, maljattiin 10 cm:n astioihin.Solut pestiin kylmällä PBS:llä ja hajotettiin 1 ml:ssa Pierce IP -lyysipuskuria (Thermo Fisher, #87787) EDTA-vapaalla proteaasi-inhibiittorilla 30 minuuttia 4 °C:ssa.Sen jälkeen lysaatit kerättiin 1,5 ml:n sentrifugiputkiin ja sentrifugoitiin 15 871 xg:ssä 10 minuuttia 4 °C:ssa.Supernatantti kerättiin ja sitä inkuboitiin 5 ug:n kanssa anti-V5-leimattua hiiren monoklonaalista vasta-ainetta (CST, #80076) yön yli 4 °C:ssa.Pese noin 50 µl proteiini A/G magneettihelmiä (MCE, #HY-K0202) kahdesti PBS:llä, joka sisältää 0,5 % Tween-20:tä.Sitten solulysaatteja inkuboitiin magneettihelmien kanssa 4 tuntia 4 °C:ssa pyörittämällä alhaalta ylös.Sitten helmet pestiin neljä kertaa 1 ml:lla PBST-puskuria ja keitettiin 95 °C:ssa 5 minuuttia.Näytteet analysoitiin SDS-PAGE-geeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvoille käyttäen standardeja Western blot -menetelmiä.Kalvot estettiin 5-prosenttisessa rasvattomassa maidossa TBST:ssä ja inkuboitiin peräkkäin primääristen ja sekundaaristen vasta-aineiden kanssa.Primaarinen vasta-aine Kanin anti-SFPQ monoklonaalista vasta-ainetta (CST, #71992) käytettiin suhteessa 1:1000 5 % rasvattomassa maidossa TBST:ssä ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa.Anti-kanin IgG:tä käytettiin suhteessa 1:5000 ja inkuboitiin 1 tunti huoneenlämpötilassa.Kalvot visualisoitiin kemiluminesenssilla käyttäen Chemidoc MP -kuvausjärjestelmää.
Kaikki rakenteet, joita käytettiin Solvent Accessible Surface Area (SASA) -analyysiin, saatiin Protein Data Bankista (PDB)52 tai AlphaFold Protein Structure Database -tietokannasta53.Absoluuttinen SASA laskettiin kullekin jäännökselle käyttämällä FreeSASA-ohjelmaa.Vain täydellisiä ja yksiselitteisiä SASA-tietoja leimatulle histidiinille ja sen naapureille käytettiin keskimääräisen SASA:n saamiseksi kullekin rakenteelle.Kunkin histidiinin suhteellinen liuottimen saavutettavuus (RSA) laskettiin jakamalla absoluuttinen SASA-arvo liuottimen käytettävissä olevalla empiirisellä suurimmalla mahdollisella jäännöspinta-alalla.Kaikki histidiinit luokiteltiin sitten piilotetuiksi, jos keskimääräinen RSA oli alle 20 %, muuten altistettu56.
DDA-tilassa saadut raakatiedostot etsittiin käyttämällä Proteome Discovereria (v2.5) tai MSfraggeria (Fragpipe v15.0) asianmukaisessa SwissProt-varmennetussa proteiinitietokannassa, joka sisälsi yleisiä kontaminantteja.Peptidit vaativat täydellisen trypsiinin, jossa oli kaksi puuttuvaa katkaisukohtaa, karbamoyylimetylaatio kiinteänä modifikaationa ja metioniinihapetus dynaamisena modifikaationa.Prekursorin ja fragmentin painotoleranssit asetettiin arvoon 10 ppm ja 0,02 Da (MS2 Orbitrap), vastaavasti. Epäpuhtaudet poistettiin ja proteiinit suodatettiin, jotta saatiin < 1 %:n virheellinen löytöaste. Epäpuhtaudet poistettiin ja proteiinit suodatettiin, jotta saatiin < 1 %:n virheellinen löytöaste. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфниющих коэфнифулицо%. Epäpuhtaudet poistettiin ja proteiinit suodatettiin antamaan virheellisen havainnoinnin osuus <1 %.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率. <1%的错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложниных1 %. Epäpuhtaudet poistettiin ja proteiinit suodatettiin, jotta saavutettiin <1 % väärä positiivisuus.Kvantitatiiviseen analyysiin ilman merkkien käyttöä käytettiin kolmen biologisen toiston normalisoitua proteiinipitoisuutta.Proteiinin subsellulaarinen lokalisointianalyysi suoritettiin käyttämällä Gene Ontology (GO) -analyysiä DAVID Bioinformatics Resourcesilta, MitoCarta 3.0 ja Alice Ting -ryhmän kokoamia ja julkaisemia tietokantoja.Tulivuorikartta saatiin Perseukselta (v1.6.15.0). Proteiinien runsauskerroinmuutosten tilastollinen merkitsevyys testattiin käyttämällä kaksipuolista t-testiä, ja proteiiniosumat tunnistettiin runsauden muutoksella >2 (ellei toisin mainita) ja p-arvolla <0,05. Proteiinien runsauskerroinmuutosten tilastollinen merkitsevyys testattiin käyttämällä kaksipuolista t-testiä, ja proteiiniosumat tunnistettiin runsauden muutoksella >2 (ellei toisin mainita) ja p-arvolla <0,05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Proteiinipitoisuuden taittomuutosten tilastollinen merkitsevyys testattiin käyttämällä kaksisuuntaista t-testiä, ja proteiinien vastaavuudet tunnistettiin sisällön muutoksilla >2 (ellei toisin mainita) ja ap-arvolla <0,05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明） 和 和 p 值 <0,05。使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 （另 有 说明） 和 和 P 值 <0,05。 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Proteiinipitoisuuden kertamuutosten tilastollista merkitsevyyttä testattiin kaksisuuntaisella t-testillä, ja proteiinien vastaavuudet määritettiin sisällön muutoksille >2 (ellei toisin mainita) ja p-arvoille <0,05.Proteiinivuorovaikutusanalyysi suoritettiin käyttämällä GO-analyysiä yhdessä String-tietokannan kanssa.
Kolme biologista toistoa suoritettiin samanlaisilla tuloksilla.Tilastollinen analyysi suoritettiin GraphPad Prism -ohjelmistolla (GraphPad-ohjelmisto) ja tulivuorikaaviot luotiin Perseuksella (v1.6.15.0).Kahden ryhmän vertailua varten p-arvot määritettiin käyttämällä kaksisuuntaista Studentin t-testiä.Tulivuorikaavioihin sisällytettiin vain koeryhmässä vähintään kahdesti tunnistetut singleton proteiinit ja vastaavat puuttuvat arvot vertailuryhmässä korvattiin normaalijakauman Perseuksella, jotta p-arvo voitiin laskea.Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± standardipoikkeama.Proteomisissa analyyseissä tilastollista analyysiä varten vähintään kahdessa biologisessa kopiossa esiintyneiden proteiinien runsaus säilyi.Otoskoon ennalta määrittämiseen ei käytetty tilastollisia menetelmiä.Kokeet eivät ole satunnaisia.Tutkijat eivät olleet sokeita tehtäville kokeen ja tulosten arvioinnin aikana.
Lisätietoja tutkimussuunnittelusta on tähän artikkeliin linkitetyssä Nature Research Reportin tiivistelmässä.
Tässä tutkimuksessa saadut massaspektrometriatiedot toimitettiin ProteomeXchange Consortiumille iProX57-kumppanitietovaraston kautta tietojoukolla ID PXD034811 (PDPL-MS-aineisto).Raakadata toimitetaan raakadatatiedostoina.Tämä artikkeli sisältää alkuperäiset tiedot.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Naapurustoon tutustuminen: läheisyydestä riippuvaisen biotinylaation käyttäminen proteiinikompleksien karakterisoimiseen ja organellejen kartoittamiseen. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Naapurustoon tutustuminen: läheisyydestä riippuvaisen biotinylaation käyttäminen proteiinikompleksien karakterisoimiseen ja organellejen kartoittamiseen.Gingras, AS, Abe, KT ja Raut, B. Ympäristön tuntemus: läheisyydestä riippuvaisen biotinylaation käyttäminen proteiinikompleksien karakterisoimiseen ja organellejen kartoittamiseen. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复征蛋白质复征義物 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Naapuruston ymmärtäminen: käytä naapuruston riippuvuutta biologisesta elämästä.Gingras, AS, Abe, KT ja Raut, B. Läheisyyden ymmärtäminen: proteiinikompleksien karakterisointi ja organellien kartoitus käyttämällä läheisyydestä riippuvaa biotinylaatiota.Nykyinen.Minun mielipiteeni.Kemiallinen.biologia 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et ai.Mikroympäristön kartoitus siirtämällä Dexter-energiaa immuunisoluihin.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et ai.Kahden proteomin mittakaavan verkot havaitsevat ihmisen interaktomin soluspesifisen uudelleenmuodostumisen.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).