Perinteiset diagnostiset strategiat tartuntatautien havaitsemiseksi edellyttävät pöytämittausinstrumenttien käyttöä, jotka eivät sovellu hoitopistetestaukseen (POCT).Emerging microfluidics on erittäin miniatyrisoitu, automatisoitu ja integroitu tekniikka, joka on mahdollinen vaihtoehto perinteisille menetelmille nopeassa, edullisessa ja tarkassa paikan päällä tehtävässä diagnostiikassa.Molekyylidiagnostiikkamenetelmiä käytetään laajalti mikrofluidilaitteissa tehokkaimpana menetelminä patogeenien havaitsemiseen.Tämä katsaus tiivistää viimeaikaiset edistysaskeleet infektiotautien mikrofluidipohjaisessa molekyylidiagnostiikassa sekä akateemisesta että teollisesta näkökulmasta.Ensin kuvaamme tyypillistä nukleiinihappojen käsittelyä sirulla, mukaan lukien näytteen esikäsittely, monistus ja signaalin lukeminen.Tämän jälkeen verrataan neljän tyyppisten mikrofluidisten alustojen ominaisuuksia, etuja ja haittoja.Seuraavaksi keskustelemme digitaalisten määritysten käytöstä nukleiinihappojen absoluuttiseen kvantifiointiin.Sekä klassiset että viimeaikaiset kaupalliset mikrofluidipohjaiset molekyylidiagnostiikkalaitteet ovat yhteenveto todisteena markkinoiden nykytilasta.Lopuksi ehdotamme tulevia suuntaviivoja infektiotautien mikrofluididiagnoosille.
Tartuntataudit aiheuttavat taudinaiheuttajat, mukaan lukien bakteerit, virukset ja loiset, jotka ovat levinneet ympäri maailmaa.Toisin kuin muut sairaudet, taudinaiheuttajat tarttuvat nopeasti ja leviävät ihmisten ja isäntäeläinten välillä rokotuksen, ilman ja veden välityksellä [1].Tartuntatautien ehkäisy on kansanterveydellisenä toimenpiteenä keskeistä.Kolme päästrategiaa tartuntatautien torjumiseksi: (1) infektion lähteen hallinta;(2) siirtotien keskeytys;(3) taudille alttiiden populaatioiden suojelu.Päästrategioista tartuntalähteen hallintaa pidetään tärkeimpänä strategiana sen mukavuuden ja alhaisten kustannusten vuoksi.Infektoituneiden yksilöiden nopea diagnoosi, eristäminen ja hoito ovat kriittisiä, ja ne edellyttävät nopeita, herkkiä ja tarkkoja diagnostiikkastrategioita [2].Nykyisessä tartuntatautien diagnosoinnissa yhdistyvät yleensä oireisiin perustuva kliininen tutkimus ja laboratoriotutkimukset, kuten soluviljelmä ja molekyylidiagnostiikka, jotka vaativat koulutettua henkilökuntaa, työvoimavaltaisia toimenpiteitä ja kalliita testauslaitteita [3, 4].Tartuntatautiepidemioiden ehkäisy edellyttää nopeaa, edullista ja tarkkaa paikallista diagnoosia erityisesti resurssirajoitteisilla alueilla, joilla tartuntataudit ovat yleisiä ja vakavia [5], sekä hoitoa erämaassa tai taistelukentällä, missä hätätilanteita ei voida ennustaa..sairaanhoito on rajoitettua [6].Tässä yhteydessä mikrofluidiikka on tekniikka, jossa yhdistyvät mikroelektromekaaniset järjestelmäteknologiat, nanoteknologia tai materiaalitiede nesteen tarkkaan manipulointiin [7,8,9,10], mikä tarjoaa uusia mahdollisuuksia hoitopisteen havaitsemiseen (POCT).) tartunnanaiheuttajia sairaaloiden ja laboratorioiden ulkopuolella.Perinteiseen aikaavievään diagnostiikkaan verrattuna mikrofluiditekniikka tarjoaa näyte- ja kustannussäästöjä molekyylidiagnostiikassa taudinpurkauksen aikana.Koronavirustaudin 2019 (COVID-19) maailmanlaajuisen leviämisen aiheuttaa vakava akuutti hengitystieoireyhtymä koronavirus 2 (SARS-CoV-2), joten mikrofluidioiden merkitys pandemian oikea-aikaisessa ehkäisyssä ja hallinnassa korostuu jälleen [11, 12 , 13].Perinteisestä diagnostiikasta poiketen mikrofluidi-POCT käyttää pieniä kannettavia laitteita, jotka vaihtelevat pöytäanalysaattoreista pieniin sivuvirtatestiliuskoihin testaamiseen lähellä näytteenottopaikkaa [14].Näissä testeissä on yksinkertaistettu tai ei lainkaan näytteen valmistelua, nopea signaalin vahvistus ja herkät signaalilukemat, jotka johtavat lyhyeen kestoon ja tarkkoihin tuloksiin muutamassa minuutissa.Mikrofluidipohjaisten terveydenhuollon instrumenttien saatavuus ja massatuotanto ovat laajentaneet niiden kustannustehokkaita ja suoria diagnostisia sovelluksia sairaalan ulkopuolella, potilaan lähellä ja jopa kotona.
Nykyisistä tartuntatautien diagnosointistrategioista molekyylidiagnostiikka on yksi herkimmistä [15, 16].Lisäksi molekyylidiagnostiikkaa käytetään usein kultaisena standardina jatkuvassa COVID-19:n havaitsemisessa, mikä mahdollistaa virusspesifisten RNA- tai DNA-alueiden suoran havaitsemisen ennen immuunivasteen alkamista [17, 18].Tässä katsauksessa esittelemme tartuntatautien mikrofluidiikkapohjaisten molekyylidiagnostiikkaprosessien viimeisimmät saavutukset akateemisesta näkökulmasta tulevaisuuden teollisiin näkökulmiin (Kuva 1).Aloitamme kolmella avainvaiheella nukleiinihappojen havaitsemisessa: näytteen esikäsittely sirulla, nukleiinihapon monistus ja signaalin lukeminen.Tämän jälkeen vertailimme erityyppisiä mikrofluidialustoja niiden rakenteeseen ja toimintaan ja osoitimme ainutlaatuisia ominaisuuksia (vahvuudet ja heikkoudet).Digitaalisesta nukleiinihapon havaitsemisesta keskustellaan edelleen ja annetaan esimerkkinä kolmannen sukupolven teknologiasta tarttuvien patogeenimolekyylien absoluuttiseen kvantifiointiin.Lisäksi esitellään useita tyypillisiä ja uusimpia kaupallisia POCT-laitteita osoittamaan molekyylidiagnostiikan mikrofluidisten POCT-markkinoiden nykytilaa.Keskustelemme ja selitämme myös visiomme tulevista sovelluksista.
Mikrofluidisirujen moduulit nukleiinihappojen havaitsemiseen voidaan jakaa kolmeen kategoriaan (näytteenotto, tunnistus ja signalointi) niiden toimintojen mukaan [19].Näistä moduuleista näytteenottomoduuli toteuttaa pääasiassa näytteen lyysin ja nukleiinihappojen uuton.Anturimoduuli ohjaa pääasiassa nukleiinihapposignaalien muuntamista ja vahvistusta.Signalointimoduuli havaitsee anturimoduulin muuntaman ja käsittelemän signaalin.Sirulla olevien nukleiinihappojen havaitsemisprosessin perusteella teemme yhteenvedon erilaisista siruista, jotka voivat toteuttaa "syöttö ja lähtö" -toiminnon.
Nukleiinihapon havaitsemisen ensimmäinen vaihe on nukleiinihappouutto eli kohdenukleiinihapon eristäminen alkuperäisestä näytteestä.Nukleiinihappouutto suoritetaan nukleiinihappojen puhdistamiseksi muista molekyylikontaminanteista, nukleiinihappomolekyylien primäärirakenteen eheyden varmistamiseksi ja tulosten optimoimiseksi.Nukleiinihappojen uuttaminen vaatii tarvittavan näytteiden lyysin ja nukleiinihappojen talteenoton, joiden laadulla ja tehokkuudella on valtava vaikutus tutkimus- ja diagnostisiin tuloksiin.Kaikki hienovaraiset sivuvaikutukset uuton aikana voivat rajoittaa havaitsemista.Esimerkiksi nukleiinihapon eristysreagensseissa olevat orgaaniset jäännösliuottimet, kuten etanoli ja isopropanoli, estävät polymeraasiketjureaktio (PCR) ja loop isothermal ampliification (LAMP) -menetelmiä [20].Neste-neste-uutto ja kiinteäfaasiuutto ovat suosituimpia menetelmiä nukleiinihappojen eristämiseen [21], mutta neste-neste-uutto sirulla on erittäin rajallista, koska neste-nesteuutossa käytetyt reagenssit aiheuttavat useimpien mikrofluidisirujen korroosiota. .Tässä korostamme microarray-pohjaisia kiinteäfaasiuuttomenetelmiä ja vertaamme niiden etuja ja haittoja.
Pii on substraattimateriaali, joka on yhteensopiva nukleiinihappojen kanssa sen biologisen yhteensopivuuden, stabiiliuden ja muuntelun helppouden vuoksi [22].Tärkeää on, että piidioksidilla tai muilla materiaaleilla modifioituna tällä komposiitilla on ominaisuuksia, jotka adsorboivat negatiivisesti varautuneita nukleiinihappoja matalan pH:n ja korkean suolan olosuhteissa samalla, kun eluoituvat korkean pH:n ja vähäsuolan liuoksilla.Tämän ilmiön perusteella on mahdollista puhdistaa nukleiinihappo.
Mikrofluidiikassa nukleiinihappojen uuttamiseen on käytetty erilaisia piidioksidipohjaisten materiaalien muotoja, kuten piidioksidihelmiä, jauheita, mikrokuitusuodattimia ja piidioksidikalvoja [23, 24, 25, 26].Materiaalin ominaisuuksista riippuen piipohjaisia materiaaleja voidaan käyttää mikropiireissä eri tavoin.Esimerkiksi piidioksidirakeita, -jauheita ja kaupallisia nanosuodattimia voidaan yksinkertaisesti sijoittaa mikrofluidisirujen huokosiin tai mikrokanaviin ja auttaa erottamaan nukleiinihappoja näytteistä [27, 28, 29].Pintamodifioituja piidioksidikalvoja voidaan käyttää myös DNA:n nopeaan puhdistamiseen patogeeneistä edullisin kustannuksin.Esimerkiksi Wang et ai.[30] Yhdistämällä denaturoivat amplifikaatioreaktiot vesikkelivälitteiseen ketjunvaihtoon kitosaanioligosakkarideilla päällystettyjen piidioksidikalvojen kanssa, otettiin käyttöön monipuolinen kannettava järjestelmä, joka havaitsi onnistuneesti 102–108 pesäkettä muodostavaa yksikköä.(CFU)/ml Vibrio parahaemolyticus., ja viruksen läsnäolo oli helposti havaittavissa.Powell et ai.[31] Piipohjaisia mikrosiruja käytettiin sitten hepatiitti C -viruksen (HCV), ihmisen immuunikatoviruksen (HIV), Zika-viruksen ja ihmisen papilloomaviruksen havaitsemiseen ja automaattiseen lisääntymiseen, jossa kehitettiin 1,3 μl:n mutkainen mikroreaktori RNA-virusten sieppaamiseen.ja suorittaa in situ -vahvistuksen.Näiden menetelmien lisäksi pintamodifioiduilla piidioksidimikrokoloneilla on myös keskeinen rooli nukleiinihappouutossa, sillä modifioivan materiaalin geometria ja ominaisuudet lisäävät uuttotehokkuutta suuresti.Chen et ai.[32] ehdotti mikrofluidista alustaa matalapitoisuuden RNA:n eristämiseksi, joka perustuu aminopäällystettyihin piimikrokolonniin.Tämä mikrofluidilaite integroi 0,25 cm2:n mikropilarien joukon piisubstraatille korkeamman uuttotehokkuuden saavuttamiseksi suuren pinta-alan ja tilavuuden suhteen ansiosta.Tämän suunnittelun etuna on, että mikrofluidilaitteella voidaan saavuttaa jopa 95 %:n nukleiinihapon uuttotehokkuus.Nämä piipohjaiset strategiat osoittavat nopeasti eristävien nukleiinihappojen arvon alhaisin kustannuksin.Yhdessä mikrofluidisirujen kanssa piipohjaiset uuttostrategiat voivat paitsi lisätä nukleiinihappojen havaitsemisen tehokkuutta, myös helpottaa analyyttisten laitteiden pienentämistä ja integrointia [20].
Magneettisissa erotusmenetelmissä käytetään magneettisia hiukkasia nukleiinihappojen eristämiseen ulkoisen magneettikentän läsnä ollessa.Yleisesti käytettyjä magneettipartikkeleita ovat Fe3O4- tai y-Fe2O3-magneettipartikkelit, jotka on päällystetty piidioksidilla, aminolla ja karboksyylillä [33,34,35,36].Magneettisten hiukkasten erottuva piirre piipohjaisiin SPE-menetelmiin verrattuna on helppokäyttöisyys ja ohjaus ulkoisilla magneeteilla.
Käyttämällä nukleiinihappojen ja piidioksidin välistä sähköstaattista vuorovaikutusta korkean suolan ja alhaisen pH:n olosuhteissa nukleiinihapot adsorboituvat piidioksidilla päällystettyjen magneettisten hiukkasten pinnalle, kun taas matalan suolan ja korkean pH:n olosuhteissa molekyylit voidaan pestä. uudelleen..Piidioksidilla päällystetyt magneettihelmet mahdollistavat DNA:n erottamisen suurista näytteistä (400 μL) magneettisesti ohjatulla liikkeellä [37].Esityksenä Rodriguez-Mateos et al.[38] käytti viritettäviä magneetteja ohjaamaan magneettisten helmien siirtoa eri kammioihin.Piidioksidilla päällystettyjen magneettisten hiukkasten perusteella jätevesinäytteistä voidaan erottaa 470 kopiota/ml SARS-CoV-2 genomista RNA:ta LAMP-käänteistranskription havaitsemista (RT-LAMP) varten ja vaste voidaan lukea 1 tunnin sisällä.paljaalla silmällä (kuva 2a).
Magneettisiin ja huokoisiin materiaaleihin perustuvat laitteet.Käsitteellinen kaavio IFAST RT-LAMP -mikrofluidilaitteesta SARS-CoV-2 RNA:n havaitsemiseen (muokattu julkaisusta [38]).b Keskipakoinen mikrolaite bukkaalisen vanupuikkonukleiinihapon dSPE:lle (muokattu kohdasta [39]).c Sisäänrakennettu omatehoinen näytekonsentraattori, joka käyttää FTA®-korttia (muokattu kohdasta [50]).d Kitosaanilla modifioitu Fusion 5 -suodatinpaperi (muokattu [51]:stä).SARS-CoV-2 vakava akuutti hengitystieoireyhtymä koronavirus 2, RT-LAMP käänteistranskriptiosilmukkavälitteinen isoterminen amplifikaatio, FTA Finders -teknologiakumppanit, NA-nukleiinihappo
Positiivisesti varautuneet magneettiset hiukkaset sopivat ihanteellisesti nukleiinihapon fosfaattirungon kiinnittämiseen.Tietyllä suolapitoisuudella nukleiinihappojen negatiivisesti varautuneet fosfaattiryhmät voivat varautua positiivisesti magneettisten komposiittihiukkasten pinnalle.Siksi nukleiinihappojen uuttamiseen kehitettiin magneettisia nanopartikkeleita, joilla on karkea pinta ja korkea aminoryhmien tiheys.Magneettisen erotuksen ja eston jälkeen magneettisia nanopartikkeleita ja DNA-komplekseja voidaan käyttää suoraan PCR:ssä, mikä eliminoi monimutkaisten ja aikaa vievien puhdistus- ja eluointitoimenpiteiden tarpeen [35].Magneettisia nanopartikkeleita, jotka on päällystetty negatiivisilla karboksyyliryhmillä, on käytetty myös erottelemaan pinnoille adsorboituneita nukleiinihappoja korkean pitoisuuden polyetyleeniglykoli- ja natriumkloridiliuoksissa [36].Näillä pintamodifioiduilla magneettihelmillä DNA-uutto on yhteensopiva myöhemmän monistuksen kanssa.Dignan et ai.[39] kuvaili automatisoidun ja kannettavan keskipako-mikrofluidialustan nukleiinihappojen esikäsittelyyn, jolloin ei-tekninen henkilökunta voi käyttää sitä paikan päällä.Lisäksi eristetyn DNA:n yhteensopivuus LAMP:n kanssa, joka on menetelmä, joka sopii hyvin hoitopisteen nukleiinihappoanalyysiin, osoittaa lisäksi minimaaliset laitteistovaatimukset ja soveltuvuuden kolorimetrisiin määrityksiin (kuvio 2b).
Magneettiset helmimenetelmät tarjoavat mahdollisuuden automaattiseen uuttamiseen, joista osa on olemassa kaupallisissa automatisoiduissa nukleiinihappouuttimissa [KingFisher;ThermoFisher (Waltham, MA, USA), QIAcube® HT;CapitalBio (Peking, Kiina) ja Biomek®;Beckman (Miami, USA).), Florida, USA)].Magneettisten helmien ja mikrofluidiikan yhdistämisen etuja voidaan käyttää tehokkaaseen nukleiinihappojen automaattiseen uuttamiseen, mikä voisi mahdollisesti edistää molekyylidiagnostiikan kehitystä;Magneettihelmien yhdistelmä mikrofluidiikkaan on kuitenkin edelleen vahvasti riippuvainen monimutkaisista ohjausjärjestelmistä magneettihelmien tarkkaan käsittelyyn, mikä selittää kaupallisten tuotteiden suosion, koska ne ovat tilaa vieviä ja kalliita, mikä rajoittaa magneettihelmien käyttöä POCT:ssä.
Nukleiinihappojen havaitsemiseen on käytetty myös useita huokoisia materiaaleja, kuten modifioituja nitroselluloosasuodattimia, Finders Technology Associates (FTA) -kortteja, polyeetterisulfonipohjaisia suodatinpapereita ja glykaanilla päällystettyjä materiaaleja [40, 41, 42, 43, 44].Huokoisia kuitumateriaaleja, kuten kuitupaperia, käytettiin ensin DNA:n eristämiseen kietomalla pitkäjuosteisia DNA-molekyylejä kuiduilla.Pienet huokoset johtavat DNA-molekyylien voimakkaaseen fyysiseen rajoittumiseen, mikä vaikuttaa positiivisesti DNA:n uuttamiseen.Kuitupaperin eri huokoskokojen vuoksi uuttotehokkuus ei voi täyttää DNA:n monistamisen tarpeita [45, 46].FTA-kortti on kaupallinen suodatinpaperi, jota käytetään oikeuslääketieteen alalla ja jota käytetään laajalti muilla molekyylidiagnostiikan alueilla.Käyttämällä eri kemikaaleilla kyllästettyä selluloosasuodatinpaperia näytteen solukalvojen hajottamiseksi, vapautunut DNA on suojattu hajoamiselta jopa 2 vuoden ajan.Viime aikoina kyllästetty selluloosapaperi on kehitetty erilaisten patogeenien, kuten SARS-CoV-2:n, leishmaniaasin ja malarian, molekyylien havaitsemiseen [47,48,49].Eristetyssä plasmassa oleva HIV hajotetaan suoraan, ja virusnukleiinihappo rikastuu konsentraattoriin rakennetussa FTA®-virtauskalvossa, mikä mahdollistaa nukleiinihapon tehokkaan tuotannon [50] (kuvio 2c).Suurin ongelma nukleiinihappojen havaitsemisessa FTA-korteilla on, että kemikaalit, kuten guanidiini ja isopropanoli, estävät myöhempiä monistusreaktioita.Tämän ongelman ratkaisemiseksi kehitimme Fusion 5 kitosaanilla muunnetun suodatinpaperin, jossa yhdistyvät sekä DNA-molekyylien ja kuitumaisen suodatinpaperin fyysisen lomituksen edut sekä DNA:n sähköstaattinen adsorptio kitosaanilla modifioituihin yhdisteisiin erittäin tehokkaan nukleiinihapon uuton saavuttamiseksi. ..suodatinkuidut [51] (kuva 2d).Samoin Zhu et ai.[52] osoitti kitosaanilla muunnetun PCR-menetelmän, joka perustuu in situ kapillaarimikrofluidijärjestelmään Zika-viruksen RNA:n nopeaan eristämiseen ja havaitsemiseen.Nukleiinihapot voidaan adsorboida/desorboida sekoitettuun lysaatti/PCR-väliaineeseen, vastaavasti, kitosaanin päälle/pois-kytkinominaisuuden perusteella.päälle ja pois”, pH-arvoon reagoiva.
Kuten edellä mainittiin, nämä strategiat yhdistävät erilaisten kiinteän faasin materiaalien edut ja lisäävät nukleiinihappojen uuton tehokkuutta mikrofluidiikassa.Käytännössä näiden materiaalien suurien määrien käyttö on epätaloudellista ja tavallisten materiaalien asianmukainen pintakäsittely tai pinnan modifiointi näillä materiaaleilla voi myös säilyttää niiden funktion.Siksi uskotaan, että näiden strategioiden toteuttaminen pilottitutkimuksen jälkeen voi vähentää kustannuksia.
Nukleiinihappotestauksessa mikrofluidisilla alustoilla käytetään usein pieniä näytetilavuuksia (< 100 µl), minkä vuoksi kohdenukleiinihappojen monistaminen erityisillä koettimilla muunnetaan signaaliksi, joka on kätevä alavirran havaitsemiseen (optinen, sähköinen ja magneettinen) [53, 54]. Nukleiinihappotestauksessa mikrofluidisilla alustoilla käytetään usein pieniä näytetilavuuksia (< 100 µl), minkä vuoksi kohdenukleiinihappojen monistaminen erityisillä koettimilla muunnetaan signaaliksi, joka on kätevä alavirran havaitsemiseen (optinen, sähköinen ja magneettinen) [53, 54]. При тестировании нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах часто используются небольшие объемы образцов (< 100 мкл), поэтому требуется амплификация целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигнал, удобный для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]. Kun nukleiinihappoja testataan mikrofluidisilla alustoilla, käytetään usein pieniä näytetilavuuksia (<100 µL), joten kohdenukleiinihappojen monistaminen erityisillä koettimilla on tarpeen, jotta se muunnetaan signaaliksi, joka on kätevä myöhempää havaitsemista varten (optinen, sähköinen ja magneettinen). [53, 54].微流控平台上的核酸检测通常使用小样本量（< 100 µl），因此需要使用特定探针扩增目标核酸，以转换为便于下游检测（光学、电学和磁学）的信号[53, 54 ].微流控 平台 上 的 核酸 检测 使用 小样本量 （（<100 µl） ， 因此 需要 特定 探针 扩增 目标 ， 以 转换 为 下游 下游 （光学 、 电学 磁学） 的 信号 [53, 54, 54, 54 ]. Обнаружение нуклеиновых кислот на микрожидкостных платформах обычно использует небольшие объемы образцов (<100 мкл), что требует амплификации целевых нуклеиновых кислот с помощью специальных зондов для преобразования в сигналы для последующего обнаружения (оптического, электрического и магнитного) [53, 54]]. Nukleiinihappojen havaitseminen mikrofluidisilla alustoilla käyttää yleensä pieniä näytetilavuuksia (<100 μl), mikä vaatii kohdenukleiinihappojen monistamista erityisillä koettimilla, jotta ne muunnetaan signaaleiksi myöhempää havaitsemista varten (optinen, sähköinen ja magneettinen) [53, 54]] .Nukleiinihapon monistus mikrofluidiikassa voi myös nopeuttaa reaktioita, optimoida havaitsemisrajoja, vähentää näytevaatimuksia ja parantaa havaitsemisen tarkkuutta [55, 56].Viime vuosina nopean ja tarkan detektion toteuttamisen myötä mikrofluidiikassa on sovellettu erilaisia nukleiinihappojen monistusmenetelmiä, mukaan lukien PCR ja eräät isotermiset amplifikaatioreaktiot.Tässä osassa esitetään yhteenveto menetelmistä nukleiinihappojen havaitsemiseksi, jotka perustuvat mikrofluidijärjestelmiin.
PCR on organismin DNA-replikaatioprosessin simulaatio, jonka teoriaa on kuvattu yksityiskohtaisesti muualla, eikä sitä käsitellä tässä.PCR voi monistaa erittäin pienen määrän kohde-DNA:ta/RNA:ta eksponentiaalisella nopeudella, mikä tekee PCR:stä tehokkaan työkalun nukleiinihappojen nopeaan havaitsemiseen.Viime vuosikymmeninä monia kannettavia mikrofluidilaitteita, jotka on varustettu PCR-lämpökiertojärjestelmillä, on kehitetty vastaamaan hoitopistediagnostiikan tarpeita [57, 58].On-chip PCR voidaan jakaa neljään tyyppiin (perinteinen, jatkuvavirtaus, spatiaalisesti kytketty ja konvektiivinen PCR) eri lämpötilansäätömenetelmien mukaan [59].Esimerkiksi Gee et ai.[60] kehittivät suoran käänteistranskription kvantitatiivisen PCR-menetelmän (RT-qPCR) omalle mikrofluidialustalleen SARS-CoV-2-, influenssa A- ja B-virusten multipleksointiin kurkkupuikkonäytteistä (kuva 3a).Park et ai.[61] rakensi yksinkertaisen patogeenianalyysisirun integroimalla ohutkalvo-PCR:n, elektrodit ja sormella ohjattavan polydimetyylisiloksaanipohjaisen mikrofluidimoduulin.Molemmat teokset ilmentävät kuitenkin tavanomaisen PCR:n yhteisiä puutteita.PCR vaatii lämpökiertoa, mikä rajoittaa laitteen miniatyrisoimista ja lyhentää testausaikaa.
Jatkuvaan virtaukseen perustuvan mikrofluidisen ja tilakytkentäisen PCR:n kehittäminen on ratkaisevan tärkeää tämän ongelman ratkaisemiseksi.Pitkää serpentiinikanavaa tai lyhyttä suoraa kanavaa käyttämällä jatkuvavirtaus-PCR voi tarjota nopean vahvistuksen kierrättämällä reagensseja aktiivisesti kolmella esilämmitysvyöhykkeellä sirun ulkopuolisella pumpulla.Tämä toimenpide välttää onnistuneesti siirtymävaiheen eri reaktiolämpötilojen välillä ja lyhentää siten merkittävästi testausaikaa [62] (kuva 3b).Toisessa tutkimuksessa Jung et al.[63] ehdotti uutta rotaatio-PCR-geenianalysaattoria, joka yhdistää kiinteän ja virtaus-PCR:n ominaisuudet ultranopeaa ja multipleksistä käänteistranskriptio-PCR:ää varten (kuva 3c).Nukleiinihappomonistusta varten PCR-mikrosirua pyöritetään kolmen kuumennuslohkon läpi eri lämpötiloissa: 1. Denaturointilohko 94 °C, 2. Hehkutuslohko 58 °C:ssa, 3. Expansiolohko 72 °C:ssa.
PCR:n käyttö mikrofluidiikassa.Kaaviomainen esitys dirRT-qPCR:stä mikrofluidisella alustalla (muokattu [60]:sta).b Kaavioesitys jatkuvan virtauksen PCR-mikroarraysta, joka perustuu serpentiinikanavaan (muokattu [62]:sta).c Kaavioesitys pyörivästä PCR-geenianalysaattorista, joka koostuu mikrosirusta, kolmesta lämmityslohkosta ja askelmoottorista (muokattu [63]:sta).d Kaavio lämpökonvektio-PCR:stä sentrifugoinnilla ja asetuksilla (mukautettu kohdasta [64]).DirRT-qPCR, suora kvantitatiivinen käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktio
Kapillaareja ja silmukoita tai jopa ohuita levyjä käyttämällä konvektio-PCR voi nopeasti monistaa nukleiinihappoja luonnollisella vapaalla lämpökonvektiolla ilman ulkoista pumppua.Esimerkiksi syklinen olefiinipolymeerin mikrofluidinen alusta kehitettiin valmistetulle pyörivälle kuumennusvaiheelle, joka käyttää lämpökiertoa sentrifugoimalla PCR-silmukan mikrokanavassa [64] (kuva 3d).Reaktioliuosta ohjaa lämpökonvektio, joka vaihtaa jatkuvasti korkeaa ja matalaa lämpötilaa rengasmaisessa mikrokanavassa.Koko vahvistusprosessi voidaan suorittaa 10 minuutissa tunnistusrajan ollessa 70,5 pg/kanava.
Kuten odotettiin, nopea PCR on tehokas työkalu täysin integroituihin näyte-vaste-molekyylidiagnostiikka- ja multipleksianalyysijärjestelmiin.Nopea PCR vähentää merkittävästi SARS-CoV-2:n havaitsemiseen tarvittavaa aikaa, mikä edesauttaa COVID-19-pandemian tehokasta hallintaa.
PCR vaatii monimutkaisen lämpösyklilaitteen, joka ei sovellu POCT:hen.Viime aikoina isotermisiä monistustekniikoita on sovellettu mikrofluidiikkaan, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen, LAMP, rekombinaasipolymeraasin monistus (RPA) ja nukleiinihapposekvensseihin perustuva monistus [65,66,67,68].Näillä tekniikoilla nukleiinihapot monistetaan vakiolämpötilassa, mikä helpottaa edullisien, erittäin herkkien kannettavien POCT-laitteiden luomista molekyylidiagnostiikkaan.
Suuritehoiset mikrofluidiikkapohjaiset LAMP-määritykset mahdollistavat tartuntatautien moninkertaisen havaitsemisen [42, 69, 70, 71].Yhdessä keskipako-mikrofluidijärjestelmän kanssa LAMP voi edelleen helpottaa nukleiinihappojen havaitsemisen automatisointia [69, 72, 73, 74, 75].Spin-and-react SlipChip kehitettiin useiden rinnakkaisten bakteerien visuaaliseen havaitsemiseen käyttämällä LAMP:ia [76] (kuva 4a).Kun määrityksessä käytettiin optimoitua LAMP:ia, fluoresenssin signaali-kohinasuhde oli noin 5-kertainen ja havaitsemisraja saavutti 7,2 kopiota/μl genomista DNA:ta. Lisäksi viiden yleisen ruoansulatuskanavan bakteeripatogeenin, mukaan lukien Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ja Vibrio parahaemolyticus, olemassaolo visualisoitiin menetelmän perusteella < 60 minuutissa. Lisäksi viiden yleisen ruoansulatuskanavan bakteeripatogeenin, mukaan lukien Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ja Vibrio parahaemolyticus, olemassaolo visualisoitiin menetelmän perusteella < 60 minuutissa.Lisäksi viiden yleisen ruoansulatuskanavan bakteeripatogeenin, mukaan lukien Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvialis ja Vibrio parahaemolyticus, läsnäolo visualisoitiin tällä menetelmällä alle 60 minuutissa.此外 ， 基于 该 方法 <60 分钟 内 可 视化 了 五 常见 消化道 细菌病 原体 原体 存在 ， 包括 蜡状 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 河流 弧菌 和 副溶血性 弧菌。。。。。。。。。。。。。。。。。。此外 ， 基于 该 方法 在 <60 分钟 内 视化 了 五 种 消化道 细菌病 的 存在 ， ， 芽孢杆菌 、 大 肠杆菌 、 肠 氏 菌 、 和 副溶血 性 。。。 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 弧菌 HIPLisäksi viiden yleisen bakteeriperäisen maha-suolikanavan patogeenin, mukaan lukien Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Vibrio fluvius ja Vibrio parahaemolyticus, läsnäolo visualisoitiin tällä menetelmällä alle 60 minuutissa.
LAMP:n etuja mikrofluidiikassa ovat muun muassa nopea vaste ja miniatyyrisoitu tunnistus.Kuitenkin johtuen reaktiolämpötilasta (noin 70 °C) LAMP:n aikana syntyy väistämättä aerosoleja, mikä johtaa korkeaan vääriin positiivisiin prosenttiosuuksiin.Määrityksen spesifisyys, alukkeen suunnittelu ja lämpötilan säätö on myös optimoitava LAMP:ia varten.Lisäksi sirumallit, jotka toteuttavat useiden kohteiden havaitsemisen yhdellä sirulla, ovat erittäin arvokkaita, ja niitä tulisi kehittää.Lisäksi LAMP sopii yhteen siruun integroituna monikäyttöiseen havainnointiin, mikä on erittäin tärkeää, mutta kehittämisen varaa on vielä paljon.
LAMP:n suurta väärää positiivista määrää voidaan osittain vähentää RPA:lla, koska suhteellisen alhainen reaktiolämpötila (~37 °C) aiheuttaa suhteellisen vähän haihtumisongelmia [77].RPA-järjestelmässä kaksi vastakkaista aluketta aloittavat DNA-synteesin sitoutumalla rekombinaasiin ja monistus voidaan saattaa loppuun 10 minuutissa [78,79,80,81].Siksi koko RPA-prosessi on paljon nopeampi kuin PCR tai LAMP.Viime vuosina mikrofluiditekniikan on osoitettu parantavan edelleen RPA:n nopeutta ja tarkkuutta [82,83,84].Esimerkiksi Liu et ai.[85] kehittivät mikrofluidisen integroidun lateraalivirtauspolymeraasirekombinaasin monistusmäärityksen SARS-CoV-2:n nopeaan ja herkän havaitsemiseen integroimalla käänteistranskription RPA (RT-RPA) ja universaalin lateraalivirtauksen testiliuskan havaitsemisjärjestelmän.yhdeksi mikrofluidijärjestelmäksi.Kuva 4b).Havaitsemisraja on 1 kopio/µl tai 30 kopiota/näyte, ja havaitseminen voidaan suorittaa noin 30 minuutissa.Kong et ai.ovat kehittäneet puettavan mikrofluidilaitteen.[86] käytti ruumiinlämpöä ja matkapuhelimeen perustuvaa fluoresenssin havaitsemisjärjestelmää HIV-1-DNA:n nopeaan ja suoraan havaitsemiseen RPA:n avulla (kuva 4c).Puettava RPA-määritys havaitsee 100 kopiota/ml kohdesekvenssiä 24 minuutissa, mikä osoittaa suuret mahdollisuudet HIV-1-tartunnan saaneiden imeväisten nopeaan diagnosointiin rajoitetuissa olosuhteissa.
Isoterminen vahvistus hoitopistetestauksessa (POCT).Kehitys ja tuotanto spin ja reaktio SlipChip.Plasmahitsauksen jälkeen ylä- ja alasirut koottiin joukolla muttereita lopullisen sirun muodostamiseksi (muokattu [76]:sta).b Kaavio MI-IF-RPA-järjestelmästä COVID-19:n havaitsemiseen (muokattu [85]).c Kaavio puettavasta RPA-testistä HIV-1-DNA:n nopeaan havaitsemiseen (muokattu [86]:sta).SE Salmonella enterica, VF Vibrio fluvius, VP Vibrio parahaemolyticus, BC Bacillus cereus, EC Escherichia coli, FAM karboksifluoreseiini, ihmisen immuunikatovirus HIV, RPA-rekombinaasipolymeraasin vahvistus, LED-valoa emittoiva diodi, MI-IF-Recominate La Microfluidics Flow-RPA Pomerase Pomerase La Microfluidics Vahvistus
Mikrofluidipohjainen RPA kehittyy nopeasti, mutta sirunvalmistuksen kustannukset ja reaktion kulutus ovat liian korkeat ja niitä on pienennettävä tämän tekniikan saatavuuden lisäämiseksi.Lisäksi RPA:n korkea herkkyys voi vaikuttaa epäspesifisten tuotteiden vahvistumiseen, erityisesti kontaminaatioiden läsnä ollessa.Nämä rajoitukset voivat vaikuttaa RPA:n käyttöön mikrofluidijärjestelmissä ja ansaita lisäoptimointia.Hyvin suunniteltuja alukkeita ja koettimia eri kohteille tarvitaan myös parantamaan RPA-pohjaisten mikrofluidisten strategioiden toteutettavuutta POCT:ssä.
Cas13:lla ja Cas12a:lla on kyky pilkkoa satunnaisesti nukleiinihappoja, joten niitä voidaan kehittää havaitsemis- ja diagnostisina työkaluina.Cas13 ja Cas12a aktivoituvat sitoutuessaan kohde-DNA:han tai RNA:han, vastaavasti.Kun proteiini on aktivoitunut, se alkaa pilkkoa muita lähellä olevia nukleiinihappoja, minkä jälkeen patogeenispesifisiin nukleiinihappoihin kohdistuvat ohjaus-RNA:t voivat pilkkoa sammutetut fluoresoivat koettimet ja vapauttaa fluoresenssia.Tämän teorian perusteella Kellner et ai.[87] kehittivät Cas13-pohjaisen menetelmän [Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKING (SHERLOCK)] ja Broughton et al.[88] kehittivät toisen lähestymistavan, joka perustuu Cas12a:han [CRISPR Trans Reporter, joka kohdistuu DNA-endonukleaasiin (DTECR)].
Viime vuosina on ilmestynyt erilaisia CRISPR:ään perustuvia menetelmiä nukleiinihappojen havaitsemiseksi [89, 90].Perinteiset CRISPR-pohjaiset menetelmät ovat usein aikaa vieviä ja työvoimavaltaisia useiden menetelmien vuoksi, mukaan lukien nukleiinihappojen uutto, monistus ja CRISPR-detektio.Nesteiden altistuminen ilmalle voi lisätä väärien positiivisten tulosten mahdollisuutta.Edellä esitetyn perusteella CRISPR-pohjaiset järjestelmät tarvitsevat kipeästi optimointia.
CRISPR-Cas12a- ja CRISPR-Cas13a-tunnistussovelluksille on kehitetty pneumaattisesti ohjattu mikrofluidialusta, joka voi suorittaa 24 analyysiä rinnakkain [91].Järjestelmä on varustettu fluoresenssin havaitsemislaitteella, joka ohittaa nukleiinihappomonistuksen ja tunnistaa automaattisesti femtomolaariset DNA- ja RNA-näytteet.Chen et ai.[92] integroitu rekombinaasiamplifikaatio CRISPR-Cas12a-järjestelmän kanssa keskipakomikrofluidiikassa (kuvio 5a).Tämä työ voittaa näiden kahden prosessin integroinnin vaikeudet, koska Cas12a voi pilkkoa lähetti-DNA:ta ja estää monistusprosessin.Lisäksi Chen et ai.[92] lisäksi esisäilyttivät reaktioreagenssit keskipako-mikrofluidikontrollissa, jotta koko prosessi saadaan automaattisesti valmiiksi.Toisessa työssä Silva et ai.[93] kehittivät diagnostisen menetelmän ilman CRISPR/Cas12a-vahvistusta ja älypuhelimen SARS-CoV-2:n havaitsemiseksi (kuva 5b).Tämä määritys, joka tunnetaan matkapuhelinpohjaisena amplifikaatiovapaana järjestelmänä, sisältää CRISPR/Cas-riippuvaisen entsyymin, joka perustuu älypuhelimen visualisointiin katalaasin synnyttämistä kuplasignaaleista mikrofluidikanavissa.Herkkä havaitseminen alle 50 kopiota/µl nukleiinihappoa ilman esiamplifikaatiota, koko prosessi näytteen injektiosta signaalin lukemiseen kestää vain 71 minuuttia.
CRISPR:ään perustuvat nukleiinihappojen havaitsemismenetelmät.Keskipako-POCT integroituun molekyylidiagnostiikkaan, joka perustuu CRISPR:ään (muokattu [92]:sta).b CASCADE-testin kehittäminen älypuhelinpohjaiseen SARS-CoV-2-analyysiin (mukautettu [93]:sta).RAA-rekombinaasiamplifikaatio, PAM:n viereinen protospacer-motiivi, CRISPR-klusterit lyhyet palindromiset toistot säännöllisin väliajoin, CASCADE-järjestelmä ilman matkapuhelimen vahvistusta CRISPR/CAS-riippuvaisilla entsyymeillä, 1-etyyli-3-[3-dimetyyliaminopropyyli]karbodi-imidihydrokloridi EDC
Viimeisenä vaiheena nukleiinihappojen havaitsemisessa signaalin havaitseminen heijastaa suoraan diagnostisia tuloksia ja on kriittinen tekijä tehokkaan, herkän ja tarkan POCT:n kehittämisessä.Signaalit voidaan lukea erilaisilla menetelmillä, kuten fluoresoivilla, sähkökemiallisilla, kolorimetrisillä ja magneettisilla strategioilla.Tässä osiossa kuvataan kunkin lähestymistavan perusteita ja verrataan infektiotautien molekyylidiagnostiikkaa mikrofluidiikassa.
Fluoresenssipohjaisia strategioita käytetään laajalti tartuntatautien POCT-diagnostiikassa niiden merkittävien etujen vuoksi: erinomainen herkkyys, alhainen hinta, helppokäyttöisyys ja hoitopisteanalyysi [94, 95].Näissä strategioissa käytetään leimattuja fluoroforeja, kuten fluoresoivia väriaineita ja nanomateriaaleja havaittavan signaalin luomiseksi (fluoresenssin tehostaminen tai sammuttaminen).Tämä havainto viittaa siihen, että fluoresenssiin perustuvat strategiat voidaan jakaa suoraan fluoresoivaan leimaamiseen, signaalin päälle ja pois päältä fluoresoivaan havaitsemiseen [96].Suora fluoresoiva leimatunnistus käyttää erityisiä fluoresoivia leimoja leimaamaan spesifisiä ligandeja, jotka synnyttävät tietyn määrän fluoresenssia, kun ne sitoutuvat valikoivasti kohteeseen.Signaalipohjaisessa fluoresenssin havaitsemisessa fluoresoivan signaalin laatu on positiivisessa suhteessa kiinnostuksen kohteena olevaan suuruuteen.Fluoresenssin intensiteetti on mitätön, jos kohdetta ei ole, ja se on havaittavissa, kun riittävä määrä kohdetta on läsnä.Sitä vastoin "signal-off"-fluoresenssilla havaittu fluoresenssin intensiteetti on kääntäen verrannollinen kohteen määrään, saavuttaen aluksi maksimiarvon ja pienenee vähitellen kohdetta suurennettaessa.Esimerkiksi käyttämällä CRISPR-Cas13a:n kohderiippuvaista trans-katkaisumekanismia Tian et ai.[97] kehittivät uuden tunnistusstrategian havaitsemaan RNA:ita, jotka ohittavat käänteistranskription suoraan (kuvio 6a).Sitoutuessaan komplementaarisiin kohde-RNA:ihin, CRISPR-Cas13-RNA-kompleksi voidaan aktivoida, mikä laukaisee transkollateralisen katkaisun epäspesifisten reportteri-RNA:iden toimesta.Fluoresoivasti leimattu reportteri [fluorofori (F)] sammutetaan sammuttimella (Q) ehjänä ja fluoresoi, kun aktivoitu kompleksi pilkkoo sen.
Sähkökemiallisen ilmaisun etuna on korkea tunnistusnopeus, helppo tuotanto, alhaiset kustannukset, helppo kuljettaa ja automaattinen ohjaus.Se on tehokas analyyttinen menetelmä POCT-sovelluksiin.Perustuu grafeenikenttätransistoreihin Gao et al.[98] kehittivät nanobiosensorin Lymen taudin antigeenien moninkertaiseen havaitsemiseen Borrelia burgdorferi -bakteerista havaitsemisrajalla 2 pg/ml (kuvio 6b).
Kolorimetrisiä määrityksiä on käytetty POCT-sovelluksissa, ja ne ovat hyötyneet siirrettävyyden, alhaisten kustannusten, valmistuksen helppouden ja visuaalisen lukemisen eduista.Kolorimetrisessä havaitsemisessa voidaan käyttää peroksidaasin tai peroksidaasin kaltaisten nanomateriaalien hapettumista, nanomateriaalien aggregaatiota ja indikaattorivärien lisäämistä kohdenukleiinihappojen läsnäoloa koskevan tiedon muuntamiseksi näkyviksi värimuutoksiksi [99, 100, 101].Erityisesti kultananohiukkasia käytetään laajalti kolorimetristen strategioiden kehittämisessä, ja koska ne pystyvät indusoimaan nopeita ja merkittäviä värimuutoksia, kiinnostus POCT-kolorimetristen alustojen kehittämiseen tartuntatautien in situ -diagnosointia varten on lisääntynyt [102].Integroidulla keskipakomikrofluidilaitteella [103] saastuneista maitonäytteistä voidaan havaita automaattisesti ruokaperäiset patogeenit 10 bakteerisolun tasolla ja tulokset voidaan lukea visuaalisesti 65 minuutissa (kuva 6c).
Magneettiset anturitekniikat voivat havaita tarkasti analyytit magneettisten materiaalien avulla, ja viime vuosikymmeninä on ollut merkittävää kiinnostusta POCT-sovelluksiin.Magneettisilla tunnistustekniikoilla on joitakin ainutlaatuisia etuja, kuten edullisia magneettisia materiaaleja kalliiden optisten komponenttien sijaan.Magneettikentän käyttö kuitenkin parantaa havaitsemisen tehokkuutta ja lyhentää näytteen valmistusaikaa [104].Lisäksi magneettisen mittauksen tulokset osoittavat suurta spesifisyyttä, herkkyyttä ja korkeaa signaali-kohinasuhdetta biologisten näytteiden merkityksettömän magneettisen taustasignaalin vuoksi [105].Sharma et ai.integroi magneettiseen tunneliliitokseen perustuvan biosensorin kannettavaan mikrosirualustaan.[106] patogeenien moninkertaiseen havaitsemiseen (kuva 6d).Biosensorit havaitsevat herkästi patogeeneista eristettyjä subnanomolaarisia nukleiinihappoja.
Tyypillinen signaalintunnistusmenetelmä.Cas13a:n hyperlokalisoidun havaitsemisen käsite (mukautettu [97]:stä).b Grafeenin nanobiosensorin FET yhdessä Lyme GroES scFv:n kanssa (mukautettu julkaisusta [98]).c Kolorimetriset indikaatiot elintarvikevälitteisten patogeenien multipleksointiin keskipako-mikrofluidisirussa: näytteet nro 1 ja nro 3 kohdepatogeeneillä ja näytteet nro 2, nro 4 ja nro 5 ilman kohdepatogeenejä (mukautettu julkaisusta [103]) .d Magneettiseen tunneliliitokseen perustuva biosensori, joka sisältää alustan, sisäänrakennetun estovahvistimen, ohjausyksikön ja virtalähteen signaalin tuottamiseen/hankimiseen (muokattu [106]:sta).GFET Grafeeni FET, Escherichia coli, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Listeria monocytogenes, PC PC, PDMS dimetikoni, PMMA polymetyylimetakrylaatti
Huolimatta yllä olevien havaitsemismenetelmien erinomaisista ominaisuuksista, niillä on silti haittoja.Näitä menetelmiä verrataan (taulukko 1), sisältäen joitain sovelluksia yksityiskohtineen (edut ja haitat).
Mikrofluidiikan, mikroelektromekaanisten järjestelmien, nanoteknologian ja materiaalitieteen kehityksen myötä mikrofluidisirujen käyttö tartuntatautien havaitsemiseen kehittyy jatkuvasti [55,96,107,108].Pienoislaitteiden ja nesteiden tarkka käsittely lisää diagnostista tarkkuutta ja kustannustehokkuutta.Siksi jatkokehitystä varten on pyritty optimoimaan ja päivittämään siruja, jolloin on saatu erilaisia mikrofluidisiruja, joilla on erilaiset rakenteet ja toiminnot.Tässä esittelemme lyhyesti useita yleisiä mikrofluidisten alustojen tyyppejä ja vertaamme niiden ominaisuuksia (edut ja haitat).Lisäksi useimmat alla luetellut esimerkit keskittyvät ensisijaisesti SARS-CoV-2:n torjuntaan.
LOCC:t ovat yleisimpiä miniatyrisoituja monimutkaisia analyyttisiä järjestelmiä, ja niiden toiminnot ovat erittäin pienikokoisia, integroituja, automatisoituja ja rinnakkaisia näytteen ruiskuttamisesta ja valmistelusta, virtauksen ohjauksesta ja nesteen havaitsemisesta [109, 110].Nesteitä manipuloidaan huolellisesti suunnitellun geometrian ja monien fysikaalisten vaikutusten, kuten painegradientien, kapillaaritoiminnan, sähködynamiikan, magneettikenttien ja akustisten aaltojen vuorovaikutuksen avulla [111].LOCC:llä on erinomaisia etuja korkean suorituskyvyn seulonnassa ja moninkertaisessa havaitsemisessa nopealla analyysinopeudella, pienellä näytekokolla, alhaisella virrankulutuksella ja korkealla hallinta- ja toimintatehokkuudella;LOCC-laitteet ovat kuitenkin erittäin herkkiä, ja niiden valmistus, pakkaus ja liitäntä.Multipleksointi ja uudelleenkäyttö kohtaavat kuitenkin valtavia vaikeuksia [96].Verrattuna muihin alustoihin LOCC:llä on ainutlaatuisia etuja sovellusten maksimaalisen monimuotoisuuden ja parhaan teknologian yhteensopivuuden suhteen, mutta sen haitat ovat myös ilmeisiä, nimittäin korkea monimutkaisuus ja huono toistettavuus.Riippuvuus ulkoisista pumpuista, jotka ovat usein tilaa vieviä ja kalliita, rajoittaa edelleen niiden käyttöä POCT:ssä.
COVID-19-epidemian aikana LOCC sai paljon huomiota.Samaan aikaan on olemassa useita uusia siruja, jotka yhdistävät useita teknologioita.Esimerkiksi älypuhelimia käytetään nykyään laajalti kannettavina analytiikkalaitteina, ja niillä on suuri potentiaali LOCC-integraatioon.Sun et ai.[21] valmistivat mikrofluidisirun, joka mahdollistaa viiden patogeenin, mukaan lukien SARS-CoV-2:n, spesifisten nukleiinihapposekvenssien multipleksoinnin LAMP:n avulla ja analysoi ne älypuhelimella tunnin kuluessa reaktion päättymisestä.Toisena esimerkkinä Sundah et ai.[112] loi molekyylikytkimen [katalyyttinen monistus molekyylin siirtymätilan kytkimellä (CATCH)] SARS-CoV-2 RNA -kohteiden suoraa ja herkkää havaitsemiseen älypuhelimilla. CATCH on yhteensopiva kannettavan LOCC:n kanssa ja saavuttaa erinomaisen suorituskyvyn (noin 8 RNA-kopiota/μl; < 1 h huoneenlämmössä) [112]. CATCH on yhteensopiva kannettavan LOCC:n kanssa ja saavuttaa erinomaisen suorituskyvyn (noin 8 RNA-kopiota/μl; < 1 h huoneenlämmössä) [112]. CATCH совместим с портативным LOCC и обеспечивает превосходную производительность (примерно 8 копность) 2.1.1.1. CATCH on yhteensopiva kannettavan LOCC:n kanssa ja tarjoaa erinomaisen suorituskyvyn (noin 8 RNA-kopiota/µl; < 1 h huoneenlämpötilassa) [112]. CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀[112]） CATCH 与便携式LOCC 兼容并具有卓越的性能（大约8 RNA 拷贝/μl；室温下< 1 尀[112]） CATCH совместим с портативными LOCC и обладает превосходной производительностью (примерно 8 копий РНК/мкри; трай 1.2.1. CATCH on yhteensopiva kannettavien LOCC:iden kanssa ja sen suorituskyky on erinomainen (noin 8 RNA-kopiota/µl; < 1 tunti huoneenlämmössä) [112].Lisäksi molekyylidiagnostiikan LOCC-laitteet käyttävät myös joitain liikkeellepanevia voimia, kuten tyhjiö-, venytys- ja sähkökenttiä.Kang et ai.[113] esitteli reaaliaikaista, erittäin nopeaa nanoplasma-siru-PCR:ää COVID-19:n nopeaan ja kvantitatiiviseen diagnosointiin kentällä käyttämällä tyhjiöplasmonista nestemäistä PCR-sirua.Li et ai.[114] kehitti sittemmin venytyskäyttöisen mikrofluidisirun, joka mahdollisti COVID-19-diagnoosin.Alusta käyttää RT-LAMP-vahvistusjärjestelmää sen määrittämiseen, onko näyte kvalitatiivisesti positiivinen vai negatiivinen.Myöhemmin Ramachandran et ai.[115] saavutti sopivat sähkökenttägradientit käyttämällä isotachoforeesia (ITP), selektiivistä ionien fokusointitekniikkaa, joka on toteutettu mikrofluidiikassa.ITP:llä kohde-RNA raa'ista nenänielun vanupuikkonäytteistä voidaan puhdistaa automaattisesti.Sitten Ramachandran et ai.[115] Yhdistämällä tämä ITP-puhdistus ITP-tehostettujen LAMP- ja CRISPR-määrityksien kanssa havaittiin SARS-CoV-2 ihmisen nenänielun vanupuikolla ja kliinisissä näytteissä noin 35 minuutissa.Lisäksi uusia ideoita syntyy jatkuvasti.Jadhav et ai.[116] ehdotti diagnostista menetelmää, joka perustuu pintatehostettuun Raman-spektroskopiaan yhdistettynä mikrofluidiseen laitteeseen, joka sisältää joko pystysuuntaisia kulta-/hopeapinnoitettuja hiilinanoputkia tai kertakäyttöisiä sähkökehrättyjä mikro-/nanoputkia.Kalvofunktionaaliset sisäänrakennetut suodatinmikrokanavat ovat kertakäyttöisiä.Laite adsorboi viruksia erilaisista kehon nesteistä/erityksistä, kuten syljestä, nenänielusta ja kyynelistä.Siten virustiitteri on runsas ja virus voidaan tunnistaa tarkasti Raman-tunnisteella.
LOAD on keskipakoinen mikrofluidialusta, jossa kaikkia prosesseja ohjataan taajuusprotokollalla, joka pyörittää mikrorakenteista substraattia [110].LOAD-laitteelle on ominaista keskipakovoiman käyttö tärkeänä käyttövoimana.Nesteet ovat myös alttiina kapillaari-, Euler- ja Coriolis-voimille.Sentrifugilaitteen avulla analyysit suoritetaan jatkuvassa nestekäytössä säteittäisestä sisäänpäin ulospäin, mikä eliminoi ylimääräisten ulkoisten letkujen, pumppujen, toimilaitteiden ja aktiivisten venttiilien tarpeen.Lyhyesti sanottuna yksi ohjausmenetelmä yksinkertaistaa käyttöä.Samassa mikrofluidikanavassa samalla etäisyydellä kuormituspisteestä nesteeseen vaikuttavat voimat ovat yhtä suuret, mikä mahdollistaa kanavarakenteen toistamisen.Siten LOAD-laitteisto on yksinkertaisempi ja taloudellisempi suunnitella ja valmistaa kuin perinteiset LOCC-laitteet, kun taas reaktiot ovat suurelta osin riippumattomia ja rinnakkaisia;Keskipakolaitteiden korkean mekaanisen lujuuden vuoksi käytettävissä oleva lastumateriaali on kuitenkin rajallinen ja pienet määrät vaikeita.autoon.Samaan aikaan useimmat LOAD-laitteet on suunniteltu vain kertakäyttöön, mikä on kallista laajamittaisessa havaitsemisessa [96, 117, 118, 119].
Viime vuosikymmeninä yhtenä lupaavimmista mikrofluidilaitteista pidetty LOAD on saanut huomattavaa huomiota tutkijoilta ja valmistajilta.Näin ollen LOAD on saavuttanut laajan hyväksynnän ja sitä on käytetty tartuntatautien molekyylidiagnostiikassa [120, 121, 122, 123, 124], erityisesti COVID-19-epidemian aikana.Esimerkiksi vuoden 2020 lopussa Ji et al.[60] osoitti suoran RT-qPCR-määrityksen SARS-CoV-2- ja influenssa A- ja B-infektioiden nopeaan ja automaattiseen rinnakkaiseen havaitsemiseen kurkun vanupuikkonäytteistä.Sitten Xiong et ai.[74] esitteli LAMP-integroidun diskoidipohjaisen mikrofluidialustan seitsemän ihmisen hengitysteiden koronaviruksen, mukaan lukien SARS-CoV-2, nopeaan, täsmälliseen ja samanaikaiseen havaitsemiseen 40 minuutissa.Vuoden 2021 alussa de Oliveira et al.[73] esitteli polystyreenivärijauheen keskipako-mikrofluidisirun, jota käytetään käsin sormenpään rotaattorilla, COVID-19:n RT-LAMP-molekyylidiagnostiikkaa varten.Myöhemmin Dignan et ai.[39] esitteli automatisoidun kannettavan sentrifugimikrolaitteen SARS-CoV-2 RNA:n puhdistamiseen suoraan bukkaalista vanupuikkoleikkeistä.Medved et ai.[53] ehdotti sisäänrakennettua SARS-CoV-2-aerosolinäytteenottojärjestelmää, jossa on pieni tilavuus pyörivä mikrofluidifluoresoiva siru, jonka havaitsemisraja on 10 kopiota/μL ja syklin vähimmäiskynnys 15 minuuttia.Suarez et ai.[75] raportoi äskettäin integroidun modulaarisen keskipako-mikrofluidialustan kehittämisestä SARS-CoV-2 RNA:n suoraa havaitsemista varten lämmöllä inaktivoiduista nenänielun vanupuikkonäytteistä käyttämällä LAMP:ta.Nämä esimerkit osoittavat LOADin suuret edut ja lupaukset COVID-19:n molekyylidiagnostiikassa.
Vuonna 1945 Muller ja Clegg [125] esittelivät ensimmäisen kerran mikrofluidikanavia paperilla käyttäen suodatinpaperia ja parafiinia.Vuonna 2007 Whitesides-ryhmä [126] loi ensimmäisen toiminnallisen paperialustan proteiinin ja glukoosin testaamiseen.Paperista on tullut ihanteellinen alusta mikrofluidiikalle.Paperilla on luontaisia ominaisuuksia, kuten hydrofiilisyys ja huokoinen rakenne, erinomainen bioyhteensopivuus, kevyt paino, joustavuus, taitettavuus, alhainen hinta, helppokäyttöisyys ja mukavuus.Klassiset µPADit koostuvat hydrofiilisistä/hydrofobisista rakenteista, jotka on rakennettu paperisubstraateille.Kolmiulotteisen rakenteen mukaan μPADit voidaan jakaa kaksiulotteisiin (2D) ja kolmiulotteisiin (3D) μPAD:eihin.2D µPAD:t valmistetaan muodostamalla hydrofobisia rajoja mikrofluidikanavien muodostamiseksi, kun taas 3D µPAD:t valmistetaan yleensä 2D-mikrofluidisen paperin kerroksista, joskus paperin taittamisen, liukutekniikoiden, avoimien kanavien ja 3D-tulostuksen avulla [96].μPADissa olevia vesipitoisia tai biologisia nesteitä ohjataan ensisijaisesti kapillaarivoimalla ilman ulkoista virtalähdettä, mikä helpottaa reagenssien esisäilytystä, näytteen käsittelyä ja multipleksointia.Tarkkaa virtauksen ohjausta ja multipleksitunnistusta haittaavat kuitenkin riittämätön tunnistusnopeus, herkkyys ja uudelleenkäytettävyys [96, 127, 128, 129, 130].
Epätavallisena mikrofluidisena alustana μPAD:tä on mainostettu ja kehitetty laajalti tartuntatautien, kuten HCV:n, HIV:n ja SARS-CoV-2:n, molekyylidiagnoosissa [131, 132].HCV:n selektiivistä ja herkkää havaitsemista varten Tengam et ai.[133] kehittivät uuden fluoresoivaan paperiin perustuvan biosensorin käyttämällä erittäin spesifistä pyrrolidinyylipeptidiin perustuvaa nukleiinihappokoetinta.Nukleiinihapot immobilisoidaan kovalenttisesti osittain hapettuneelle selluloosapaperille pelkistävällä alkyloinnilla aminoryhmien ja aldehydiryhmien välillä, ja havaitseminen perustuu fluoresenssiin.Nämä signaalit voidaan lukea erityisesti tehdyllä vempaimella, jossa on kannettava fluoresoiva kamera yhdessä matkapuhelimen kameran kanssa.Tämän jälkeen Lu et ai.[134] suunnitteli paperipohjaisen joustavan elektrodin, joka perustuu nikkelin/kultan nanohiukkasiin/hiilinanoputkiin/polyvinyylialkoholin organometallirunkokomposiitteihin HIV-kohteen havaitsemiseen DNA-hybridisaatiolla käyttämällä metyleenisinistä DNA-pelkistysindikaattorina.Viime aikoina Chowdury et ai.[135] esitteli hypoteettisen alustan µPAD-testaukseen hoitopisteessä käyttämällä potilaan raakaa sylkeä yhdessä LAMP:n ja kannettavan kuvantamistekniikan kanssa COVID-19-analyytin havaitsemiseen.
Sivuvirtaustestit ohjaavat nesteitä kapillaarivoimilla ja ohjaavat nesteen liikettä huokoisten tai mikrorakenteisten alustojen kostuvuuden ja ominaisuuksien perusteella.Sivuvirtauslaitteet koostuvat näytteestä, konjugaatista, inkubaattorista ja detektorista sekä imukykyisistä tyynyistä.LFA:n nukleiinihappomolekyylit tunnistavat spesifisiä sideaineita, jotka on ennalta varastoitu sitoutumiskohtaan, ja sitoutuvat komplekseina.Kun neste kulkee inkubointi- ja tunnistuslevyjen läpi, testi- ja kontrollilinjoilla olevat sieppausmolekyylit sieppaavat kompleksit, mikä näyttää tulokset, jotka voidaan lukea suoraan paljaalla silmällä.Yleensä LFA voidaan suorittaa 2–15 minuutissa, mikä on nopeampaa kuin perinteinen löytö.Erikoismekanismin ansiosta LFA vaatii vähän operaatioita eikä vaadi lisälaitteita, mikä tekee siitä erittäin käyttäjäystävällisen.Se on helppo valmistaa ja pienentää, ja paperipohjaisten substraattien kustannukset ovat alhaisemmat.Sitä käytetään kuitenkin vain kvalitatiiviseen analyysiin, ja kvantitatiivinen havaitseminen on erittäin vaikeaa, ja multipleksointikyky ja suorituskyky ovat hyvin rajalliset, ja vain yksi riittävä nukleiinihappo voidaan havaita kerrallaan [96, 110, 127].
Vaikka useimmat LFA:n sovellukset keskittyvät immuunimäärityksiin, LFA:n käyttö mikrofluidisirujen molekyylidiagnostiikassa on myös tehokasta ja suosittua [136].Hepatiitti B -viruksen tapauksessa HIV ja SARS-CoV-2 LFA Gong et ai.[137] ehdotti ylöspäin muuntavaa nanopartikkeli-LFA-alustaa ja osoitti tämän miniatyyrisoidun ja kannettavan alustan monipuolisuuden useiden kohteiden, kuten HBV-nukleiinihapon, herkän ja kvantitatiivisen havaitsemisen avulla.Lisäksi Fu et ai.[138] osoitti uuden LFA:n, joka perustuu pintatehostettuun Raman-spektroskopiaan HIV-1-DNA:n kvantitatiiviseen analyysiin pieninä pitoisuuksina.SARS-CoV-2:n nopeaa ja herkkää havaitsemista varten Liu et al.[85] kehittivät mikrofluidiin integroidun RPA-sivuvirtausanalyysin yhdistämällä RT-RPA:n ja universaalin lateraalivirtauksen tunnistusjärjestelmän yhdeksi mikrofluidijärjestelmäksi.
Erilaisten mikrofluidisten alustojen käyttökohteet vaihtelevat yksittäisten tutkimusten mukaan hyödyntäen täysimääräisesti alustojen ominaisuuksia ja etuja.Edullisten venttiilien, pumppujen ja kanavien ansiosta LOCC on kattavin alusta sovellusten monipuolisuudelle ja yhteentoimivuudelle, jossa on eniten kehitysmahdollisuuksia.Siksi toivomme ja suosittelemme, että uusimmat tutkimukset tehdään LOCC:ssä ensimmäisenä yrityksenä ja olosuhteet optimoidaan.Lisäksi järjestelmässä odotetaan löydettävän ja käyttävän tehokkaampia ja tarkempia menetelmiä.LOAD on erinomaista nykyisten LOCC-laitteiden nesteiden tarkassa ohjauksessa ja osoittaa ainutlaatuisia etuja yksittäisissä käytöissä keskipakovoimalla ilman ulkoisten käyttölaitteiden tarvetta, kun taas rinnakkaiset vasteet voidaan erottaa ja synkronoida.Siten LOADista tulee tulevaisuudessa tärkein mikrofluidialusta, jossa on vähemmän manuaalisia toimintoja ja kehittyneempiä ja automatisoituneempia tekniikoita.µPAD-alustassa yhdistyvät LOCC:n ja paperipohjaisten materiaalien edut edulliseen kertakäyttöiseen diagnostiikkaan.Siksi tulevassa kehityksessä tulisi keskittyä käteviin ja vakiintuneisiin teknologioihin.Lisäksi LFA sopii hyvin paljain silmin havaitsemiseen, mikä lupaa vähentää näytteen kulutusta ja nopeuttaa havaitsemista.Yksityiskohtainen alustavertailu on esitetty taulukossa 2.
Digitaaliset analyysit jakavat näytteen useisiin mikroreaktoreihin, joista jokainen sisältää erillisen määrän kohdemolekyylejä [139, 140].Digitaaliset määritykset tarjoavat merkittäviä etuja absoluuttisen kvantifioinnin suorittamisessa suorittamalla tuhansia rinnakkaisia biokemiallisia kokeita samanaikaisesti ja yksittäin mikronikokoisissa osastoissa jatkuvan vaiheen sijaan.Perinteisiin mikrofluidiikoihin verrattuna osastoreaktiot voivat vähentää näytteen tilavuutta, lisätä reaktion tehokkuutta ja olla helposti integroitavissa muihin analyyttisiin menetelmiin ilman kanavien, pumppujen, venttiilien ja kompaktien rakenteiden tarvetta [141, 142, 143, 144, 145, 146, 147].Digitaalisissa määrityksissä käytetään seuraavia kahta menetelmää liuosten, mukaan lukien reagenssit ja näytteet, kuten solut, nukleiinihapot ja muut hiukkaset tai molekyylit, yhtenäisen ja tarkan erottelun saavuttamiseksi: (1) pisaraemulsiot, jotka käyttävät hyväkseen nesteen rajapinnan epästabiilisuutta;(2) Matriisijako suoritetaan laitteen geometristen rajoitusten mukaan.Ensimmäisessä menetelmässä pisaroita, jotka sisältävät reagensseja ja näytteitä mikrokanavissa, voidaan luoda passiivisilla menetelmillä, kuten rinnakkaisvirtauksella, ristivirtauksella, virtausfokusoinnilla, vaiheittaisella emulgaatiolla, mikrokanavaemulgoinnilla ja kalvoilla viskoosien leikkausvoimien avulla ja emulgoimalla kanavan vaihdolla.lokalisointi [143, 145, 146, 148, 149] tai käyttämällä aktiivisia menetelmiä [150, 151], jotka tuovat lisäenergiaa sähköisen, magneettisen, termisen ja mekaanisen ohjauksen kautta.Jälkimmäisessä lähestymistavassa paras nestetilavuuden tasaisuus mikrofluidikammioissa jaetaan pitämällä tilarakenteet samankokoisina, kuten mikrokuopat ja pintamatriisit [152,153,154].Erityisesti pisarat ovat suuria virtausosia, joita voidaan myös luoda ja käsitellä digitaaliseen mikrofluidikkaan (DMF) perustuvissa elektrodiryhmissä.Eristeiden sähkökostutus on yksi parhaiten tutkituista DMF-teorioista, koska eristeiden sähkökastelu mahdollistaa yksittäisten pisaroiden tarkan manipuloinnin, nesteen muodon säätelyn ja eri puolien läpi kulkevien epäsymmetristen sähköisten signaalien [141, 144].Tärkeimmät toiminnot pisaroiden kanssa DMF:ssä ovat lajittelu, jakaminen ja yhdistäminen [151, 155, 156], joita voidaan soveltaa useilla analyysialoilla, erityisesti molekyylien havaitsemisessa [157, 158, 159].
Digitaalinen nukleiinihappodetektio on kolmannen sukupolven molekyylidiagnostiikkatekniikka, joka seuraa tavanomaista PCR:ää ja kvantitatiivista reaaliaikaista PCR:ää (qPCR) rinnakkain suuren suorituskyvyn sekvensoinnin ja nestebiopsian kanssa.Kahden viime vuosikymmenen aikana digitaaliset nukleiinihapot ovat kehittyneet nopeasti infektiopatogeenien molekyylidiagnostiikan alalla [160, 161, 162].Digitaalisen nukleiinihapon havaitsemisen absoluuttinen kvantifiointi alkaa näytteiden ja reagenssien pakkaamisella yksittäisiin osastoihin sen varmistamiseksi, että jokaisella kohdesekvenssillä on sama todennäköisyys päästä jokaiseen yksittäiseen osastoon.Teoreettisesti kullekin osalle voidaan osoittaa useita kohdesekvenssejä, tai riippumatonta mikroreaktiojärjestelmää ei ehkä ole olemassa.Yllä kuvattujen erilaisten tunnistusmekanismien avulla osastot, joissa on tietyn kynnyksen ylittäviä signaaleja tuottavia mikrobien kohdesekvenssejä, voidaan visualisoida paljaalla silmällä tai koneella ja merkitä positiivisiksi, kun taas muut osat, jotka tuottavat signaaleja kynnyksen alapuolella, on merkitty positiivisiksi. .negatiiviset, jotka tekevät kunkin osan signaalista loogisen.Näin ollen laskemalla syntyneiden osastojen lukumäärä ja positiivisten tulosten määrä reaktion jälkeen, testinäytteiden alkuperäiset kopiot voidaan sovittaa Poisson-jakaumakaavan avulla ilman standardikäyrää, jota tarvitaan rutiininomaisissa kvantitatiivisissa analyyseissä, kuten esim. kuin qPCR.[163] Verrattuna perinteisiin molekyylidiagnostiikan menetelmiin digitaalisella nukleiinihappodetektiolla on korkeampi automaatioaste, suurempi analyysinopeus ja herkkyys, vähemmän reagensseja, vähemmän kontaminaatiota ja yksinkertaisempi suunnittelu ja valmistus.Näistä syistä digitaalisten määritysten, erityisesti pisarapohjaisten menetelmien, käyttöä molekyylidiagnostiikassa, joissa yhdistetään vahvistus- ja signaalinlukutekniikat, on tutkittu hyvin SARS-CoV-2:n kriittisen puhkeamisen aikana.Esimerkiksi Yin et ai.[164] yhdisti pisaradigitaaliset ja nopeat PCR-menetelmät ORF1ab-, N- ja RNaasi P -geenien havaitsemiseksi SARS-CoV-2:ssa mikrofluidisirusta.Erityisesti järjestelmä pystyi tunnistamaan positiivisen signaalin 115 sekunnissa, mikä on nopeampi kuin tavanomainen PCR, mikä osoittaa sen tehokkuuden hoitopisteen havaitsemisessa (kuva 7a).Dong et ai.[165], Sow et ai.[157], Chen et ai.[166] ja Alteri et ai.[167] käytti myös pisaradigitaalista PCR:ää (ddPCR) SARS-CoV-2:n havaitsemiseen mikrofluidijärjestelmässä vaikuttavin tuloksin.Havaintonopeuden edelleen parantamiseksi Shen et ai.[168] saavutti ddPCR-pohjaisen sirukuvauksen vain 15 sekunnissa ilman kuvien yhdistämistekniikoita, mikä nopeuttaa ddPCR-teknologian prosessia laboratoriosta sovellukseen.Ei käytetä vain lämpömonistusmenetelmiä, kuten PCR, vaan myös isotermisiä monistusmenetelmiä käytetään yksinkertaistamaan reaktio-olosuhteita ja nopeaa vastetta.Lu et ai.[71] kehitti SlipChipin pisara-analyysiin, joka pystyy tuottamaan erikokoisia pisaroita suurilla tiheyksillä yhdessä vaiheessa ja kvantifioimaan SARS-CoV-2-nukleiinihapot käyttämällä digitaalista LAMP:ia (kuva 7b).Nopeasti kehittyvänä teknologiana CRISPR voi myös olla tärkeässä roolissa digitaalisessa nukleiinihappojen havaitsemisessa kätevän kolorimetrisen kuvantamisen avulla ilman, että tarvitaan ylimääräisiä nukleiinihappovärjäyksiä.Ackerman et ai.kehitti kombinatorisen matriisireaktion nukleiinihappojen multipleksointiin.[158] havaitsi 169 ihmisiin liittyvää virusta, mukaan lukien SARS-CoV-2, pisaroista, jotka sisälsivät CRISPR-Cas13-pohjaisia nukleiinihapon havaitsemisreagensseja mikrokuoppamäärityksessä (kuva 7c).Lisäksi isotermistä vahvistusta ja CRISPR-teknologiaa voidaan käyttää samassa järjestelmässä yhdistämään molempien edut.Park et ai.[169] Digitaalinen CRISPR/Cas12a-määritys kehitettiin kaupalliseen mikrofluidisiruun uutetun ja lämmöllä tapetun SARS-CoV-2:n havaitsemiseksi, joka perustuu yksivaiheiseen RT-RPA:han lyhyemmällä ja korkeammalla signaali-tausta-tunnistuksella. aikasuhde., laajempi dynaaminen alue ja parempi herkkyys (kuva 7d).Taulukossa 3 on joitain kuvauksia näistä esimerkeistä.
Tyypillinen digitaalinen alusta nukleiinihappojen havaitsemiseen.a Nopea digitaalinen PCR-työnkulku koostuu neljästä avainvaiheesta: näytteen valmistelu, reaktioseoksen jakaminen, monistusprosessi ja kohteen kvantifiointi (mukautettu julkaisusta [164]).b Kaaviokuva, joka esittää SlipChip-pisaroiden analyysin pisaroiden muodostusta suurella tiheydellä (mukautettu kohdasta [71]).c CARMEN-Casin työnkulkukaavio13 (muokattu [158]:sta).d Yleiskatsaus edistyneeseen digitaaliseen virusten havaitsemiseen CRISPR/Cas:lla yhdessä potissa (mukautettu julkaisusta [169]).W/O vesi-öljyssä, polydimetyylisiloksaani PDMS, PCR-polymeraasiketjureaktio, DAQ-tiedonkeruu, PID-suhteellinen integraalinen johdannainen, CARMEN-kombinatorinen matriisireaktio nukleiinihappojen multipleksointiin, SARS-CoV-2, vaikea akuutti hengitystieoireyhtymä, koronavirus 2, RT Käänteistranskriptaasirekombinaasipolymeraasi-RPA:n vahvistus, S/B-signaali taustalla
Postitusaika: 15.9.2022
